一种猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测
技术领域：
，尤其涉及一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒。
背景技术：
：：胞内劳森菌(lawsoniaintracellularis，li)是一种专性细胞内寄生细菌，主要寄生在猪肠黏膜上皮细胞内，引起猪的增生性肠炎。临床上导致发病猪食欲下降、拉稀和生长发育迟缓，给养猪业造成巨大的经济损失。猪增生性肠炎自1931年被报道以来，已经在世界主要养猪国家存在和流行。我国对胞内劳森菌感染的关注度并不高，有关该菌在我国猪群中的流行现状尚没有全面和明确的了解。造成这种现状的主要原因除了关注度不高之外，更主要的原因是由于检测方法的欠缺。血清学诊断无论是在了解疾病流行情况、抗体水平检测、评价疫苗免疫效果还是评价药物治疗效果等方面都发挥重要作用，血清学诊断是控制疾病流行的关键步骤。对于胞内劳森菌的血清学诊断，已有学者运用免疫过氧化物酶单层细胞测定(ipma)和间接免疫荧光试验(ifat)检测劳森菌的抗体，但这两种方法均需要荧光显微镜，对人员及设备的要求较高，而且试验结果判定的主观性较强。boesen等采用培养的胞内劳森菌的脱氧胆酸钠提取物作为包被抗原建立了一种检测胞内劳森菌特异性抗体的elisa，所建立的elisa方法能很好地用于猪增生性肠炎的诊断和猪群中增生性肠炎的流行状况评价。但胞内劳森菌是一种严格的细胞内寄生细菌，培养条件要求苛刻。目前世界上仅有少数实验室实现了胞内劳森菌的分离培养，通过培养细菌获取包被抗原具有很大的难度且成本很高。因此，制备替代胞内劳森菌全菌的新型elisa包被抗原，进而研制具有我国独立自主知识主权的猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒意义重大，前景广阔。lsaa蛋白是胞内劳森菌的一种表面蛋白，在胞内劳森菌感染过程中合成，参与胞内劳森菌的黏附和侵袭。编码合成lsaa蛋白的天然lsaa基因长为0.7kb，仅含一个orf，编码蛋白的分子量约为27.4kda。由于每种生物在对基因进行翻译时对密码子的利用率有较大差异，这种差异直接影响基因表达的水平。而胞内劳森菌是一种专性细胞内寄生细菌，主要寄生在猪肠黏膜上皮细胞内。密码子利用率分析发现lsaa蛋白的密码子在原核表达体系(大肠杆菌)中的利用率较低，因此，如果将编码合成lsaa蛋白的天然lsaa基因直接克隆至原核表达体系中，容易导致lsaa蛋白的表达量较低。为了解决这个问题，本发明根据大肠杆菌密码子嗜好性，对编码合成lsaa蛋白的基因序列进行优化，使其密码子在大肠杆菌中具有高利用率，从而实现lsaa蛋白可在大肠杆菌中高水平表达，然后利用纯化的lsaa重组蛋白替代胞内劳森菌全菌提取物作为包被抗原，制备一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒。该猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒特异性强、稳定性好，能够用于猪群中猪胞内劳森菌抗体水平的检测，以判断猪群中猪胞内劳森菌的感染情况和检测免疫效果等。为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒，所述猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的抗原，所述抗原为lsaa重组蛋白，所述lsaa重组蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。根据上述的猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒，优选地，所述lsaa重组蛋白是由具有seq.id.no.2所示的核苷酸序列的基因编码。根据上述的猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒，所述lsaa重组蛋白的制备方法为：合成opt-lsaa基因，将opt-lsaa基因克隆至pet-32a载体得到重组表达载体pet-32a-opt-lsaa；将重组表达载体pet-32a-opt-lsaa转化入宿主菌中，挑选出含有重组表达载体pet-32a-opt-lsaa的阳性克隆菌，对阳性克隆菌进行iptg诱导表达；将表达产物通过ni-nta琼脂糖亲和层析柱纯化后，获得纯化的lsaa重组蛋白；其中，所述opt-lsaa基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。根据上述的猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒，优选地，所述重组表达载体pet-32a-opt-lsaa构建的具体过程为：合成opt-lsaa基因，并且在opt-lsaa基因序列的5’端加上ndei限制性核酸内切酶识别位点，在其3’端加上xhoi限制性核酸内切酶识别位点；将opt-lsaa基因与pet-32a载体分别用ndei和xhoi限制性核酸内切酶进行双酶切，将酶切后的opt-lsaa基因与pet-32a载体连接，即得到重组表达载体pet-32a-opt-lsaa。更优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。根据上述的猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒，优选地，所述固相载体为酶标板，酶标板每孔包被lsaa重组蛋白0.2μg。根据上述的猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒，优选地，所述猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒还包括酶标抗体、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、样品及抗体稀释液、显色液和终止液。更加优选地，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪igg；所述阳性对照血清为以lsaa重组蛋白免疫猪后，采集含有抗lsaa重组蛋白抗体的猪血清，即为阳性对照血清；所述阴性对照血清为未感染胞内劳森菌的健康猪血清。本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的制备：1、试剂的配制：(1)包被液：ph9.6的0.05m碳酸盐缓冲液，其配制为：取na2co30.159g、nahco30.294g用少量无菌水溶解，然后再加无菌水定容至100ml；(2)浓缩洗涤液：10倍洗涤液(用双蒸水10倍稀释为工作液)，用双蒸水稀释10倍后为含0.5％(v/v)tween-20的0.1m的pbs缓冲液(ph7.2-7.4)；(3)样品稀释液：含有5％(w/v)脱脂奶和含0.5％(v/v)吐温-20的0.1mpbs缓冲液(ph7.2-7.4)；(4)酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的兔抗猪igg(abcam公司生产)，用样品稀释液以体积比1:10000稀释而得。(5)阴性对照血清：采集未感染猪胞内劳森菌的健康猪血清，即为阴性对照血清。(6)阳性对照血清：以lsaa重组蛋白免疫猪后，采集含有抗lsaa重组蛋白抗体的猪血清，即为阳性对照血清。(7)显色液：显色液由显色液a和显色液b组成；所述显色液a的配制方法为：将200mg四甲基联苯胺溶于100ml的无水乙醇中，然后用双蒸水定容至1000ml，即得显色液a；所述显色液b的配制方法为：称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，充分溶解于400ml双蒸水中，再加入0.75％过氧化氢尿素6.4ml，然后用双蒸水定容至1000ml，调节ph值为4.5-5.0；显色液a和显色液b均为60ml；(8)终止液：2mh2so4溶液。2、包被lsaa重组蛋白的酶标板的制备：包被lsaa重组蛋白的酶标板的制备方法具体步骤如下：(1)抗原稀释、包被：将纯化的lsaa重组蛋白用包被液(ph9.6的0.05m碳酸盐缓冲液)进行稀释，稀释至浓度为2μg/ml，取稀释后的lsaa重组蛋白按100μl/孔的量加入96孔酶标板中，37℃孵育1h后，4℃过夜；(2)洗涤：弃去96孔酶标板孔内的液体，然后向酶标板孔内加入洗涤液(10倍浓缩洗涤液用双蒸水稀释10倍稀释)，300μl/孔，重复洗涤5次，每次5min(每次洗涤是都应弃去酶标板孔中液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上排干)；(3)封闭：向96孔酶标板中加入5％脱脂奶(加入量为300μl/孔)，37℃封闭2h，然后按照步骤(2)洗涤，用自粘型密封膜封闭酶标板，包装于密封袋中，4℃保存。3、本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的组成：(1)包被lsaa重组蛋白的酶标板5块；(2)阴性对照血清和阳性对照血清各2ml；(3)酶标抗体，规格为60ml；(4)浓缩洗涤液，规格为200ml；(5)样品稀释液，规格为150ml；(6)显色液a，规格为60ml；(7)显色液b，规格为60ml；(8)终止液，规格为30ml。本发明取得的积极有益效果：(1)本发明根据大肠杆菌密码子嗜好性，对genbank中登录的猪胞内劳森菌lsaa基因序列(登录号af498259)进行dna分析及rna结构预测，在不改变lsaa蛋白氨基酸序列的前提下对lsaa基因进行人工优化，得到opt-lsaa基因，使得lsaa蛋白的密码子在大肠杆菌中具有高利用率，从而实现了胞内劳森菌的lsaa蛋白在大肠杆菌中高水平表达，有效解决了编码合成lsaa蛋白的原始lsaa基因直接克隆至大肠杆菌中lsaa蛋白的表达量较低的问题。(2)本发明依据间接elisa的原理，然后利用原核表达体系合成的纯化的lsaa重组蛋白替代胞内劳森菌全菌提取物作为包被抗原，制备了一种包被有lsaa重组蛋白的猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒，该试剂盒具有灵敏度较高、特异性强、稳定性好等特点，而且，使用方便，操作简单，检测时间短，使用成本低，可用于猪群猪胞内劳森菌感染情况的血清学调查、抗体检测及疫苗免疫效果的评价等方面，适合大规模推广使用。附图说明图1为人工优化合成的opt-lsaa基因插入原核表达载体pet-32a中得到的重组表达载体pet-32a-opt-lsaa的酶切鉴定图；其中：泳道1为dnamarkerdl15000；泳道2为重组表达载体pet-32a-opt-lsaa的双酶切片段；泳道3为未进行酶切的重组表达载体pet-32a-opt-lsaa。图2为含有重组表达载体pet-32a-opt-lsaa的阳性克隆菌经iptg诱导表达后，表达产物的sds-page检测电泳图；其中：泳道1为低分子量蛋白marker；泳道2为未诱导的含有重组表达载体pet-32a-opt-lsaa的阳性克隆菌；泳道3为iptg诱导的阳性克隆菌；泳道4为iptg诱导的阳性克隆菌破菌后的上清；泳道5为iptg诱导的阳性克隆菌破菌后的沉淀；泳道6为纯化后的lsaa重组蛋白。图3纯化后lsaa重组蛋白的抗原性鉴定图；其中：泳道1为预染分子量蛋白marker；泳道2为纯化后的lsaa重组蛋白与猪胞内劳森菌阳性血清反应；泳道3为纯化后的lsaa重组蛋白与猪胞内劳森菌阴性血清反应。具体实施方式以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的原料、化学试剂均为常规市售商品，所用的技术手段为本领域技术人员所公知的常规手段。除非特别说明，本发明使用的试剂和试剂盒均为市购。实施例1：opt-lsaa基因的合成和重组表达载体pet-32a-opt-lsaa的构建本发明根据大肠杆菌密码子嗜好性，对genbank中登录的猪胞内劳森菌lsaa基因序列(登录号af498259)进行dna分析及rna结构预测，在不改变lsaa蛋白氨基酸序列的前提下对编码合成lsaa蛋白的lsaa基因进行人工优化，得到opt-lsaa基因，该人工优化合成的opt-lsaa基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。在上述人工优化合成的opt-lsaa基因序列的5’端加上ndei限制性核酸内切酶识别位点，在其3’端加上xhoi限制性核酸内切酶识别位点；将opt-lsaa基因与pet-32a载体分别用ndei和xhoi限制性核酸内切酶进行双酶切，将酶切后的opt-lsaa基因与pet-32a载体用t4dna连接酶连接，连接产物转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布于含有100μg·ml-1amp的lb固体培养平板上，37℃恒温培养箱培养过夜；挑取lb培养平板上的单克隆菌落接种于含有100μg·ml-1amp的lb液体培养基中，37℃震荡培养过夜，试剂盒提取菌液质粒进行pcr鉴定，鉴定为阳性的质粒再经双酶切鉴定，双酶切鉴定为阳性的质粒送测序公司进行测序，最终得到测序正确的重组表达载体pet-32a-opt-lsaa(图1)。实施例2：lsaa重组蛋白的诱导表达与纯化将实施例1中测序正确的重组表达载体pet-32a-opt-lsaa转化到e.colibl21(de3)感受态细胞中，然后将转化后的e.colibl21(de3)涂布至含有100μg·ml-1amp的lb固体培养平板，37℃过夜培养。次日挑取单菌落于含有100μg·ml-1amp的lb液体培养基中，37℃250r·min-1，培养至od600nm约为0.8，加入iptg至终浓度0.1mmol·l-1，37℃，250r·min-1振荡诱导培养6h。将诱导培养后的菌液经4000rpm离心10min，弃去上清，收集菌体沉淀；用0.1mpbs重悬沉淀，超声处理5min(超声9s，停止6s)破碎菌体，然后10000rpm4℃离心10min，分别收集上清和沉淀，沉淀用0.1mpbs重悬，进行sds-page电泳鉴定蛋白是否可溶性表达。sds-page电泳鉴定结果如图2所示，由图2可知，lsaa重组蛋白的表达形式为包涵体。因lsaa重组蛋白融合有多聚组氨酸(6×his)标签，故采用ni-nta蛋白纯化试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)纯化表达产物中的lsaa重组蛋白，纯化后得到大小为27kda，条带单一的lsaa重组蛋白(图2)。实施例3：lsaa重组蛋白的鉴定对纯化后的lsaa重组蛋白进行westernblot分析其抗原性，其具体操作为：经过sds-page电泳后分离得到的lsaa重组蛋白，转移至硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜置于含5％(w/v)脱脂奶粉的封闭液中4℃封闭过夜。用含有5％(w/v)脱脂奶和0.5％(v/v)吐温-20的pbs缓冲液按照体积比为1:200的比例稀释猪抗胞内劳森菌阳性血清，作为一抗，37℃孵育2h，洗膜后用含有5％(w/v)脱脂奶和0.5％(v/v)吐温-20的pbs缓冲液按照体积比为1:5000的比例稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗猪igg，作为二抗，37℃孵育2h，最后用dab显色试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)显色。结果表明，纯化后的lsaa重组蛋白具有良好的抗原性(图3)。实施例4：本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的制备1、试剂的配制：(1)包被液：ph9.6的0.05m碳酸盐缓冲液，其配制为：取na2co30.159g、nahco30.294g用少量无菌水溶解，然后再加无菌水定容至100ml；(2)浓缩洗涤液：10倍洗涤液(用双蒸水10倍稀释为工作液)，用双蒸水稀释10倍后为含0.5％(v/v)tween-20的0.1m的pbs缓冲液(ph7.2-7.4)；(3)样品稀释液：含有5％(w/v)脱脂奶和含0.5％(v/v)吐温-20的0.1mpbs缓冲液(ph7.2-7.4)；(4)酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的兔抗猪igg(abcam公司生产)，用样品稀释液以体积比1:10000稀释而得。(5)阴性对照血清：采集未感染猪胞内劳森菌的健康猪血清，即为阴性对照血清。(6)阳性对照血清：以lsaa重组蛋白免疫猪后，采集含有抗lsaa重组蛋白抗体的猪血清，即为阳性对照血清。(7)显色液：显色液由显色液a和显色液b组成；所述显色液a的配制方法为：将200mg四甲基联苯胺溶于100ml的无水乙醇中，然后用双蒸水定容至1000ml，即得显色液a；所述显色液b的配制方法为：称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，充分溶解于400ml双蒸水中，再加入0.75％过氧化氢尿素6.4ml，然后用双蒸水定容至1000ml，调节ph值为4.5-5.0；显色液a和显色液b均为60ml；(8)终止液：2mh2so4溶液。2、包被lsaa重组蛋白的酶标板的制备：包被lsaa重组蛋白的酶标板的制备方法具体步骤如下：(1)抗原稀释、包被：将实施例2得到的纯化的lsaa重组蛋白用包被液进行稀释，稀释至浓度为2μg/ml，取稀释后的lsaa重组蛋白按100μl/孔的量加入96孔酶标板中，37℃孵育1h后，4℃过夜；(2)洗涤：弃去96孔酶标板孔内的液体，然后向酶标板孔内加入洗涤液(10倍浓缩洗涤液用双蒸水稀释10倍稀释)，300μl/孔，重复洗涤5次，每次5min(每次洗涤是都应弃去酶标板孔中液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上排干)；(3)封闭：向96孔酶标板中加入5％脱脂奶(加入量为300μl/孔)，37℃封闭2h，然后按照步骤(2)洗涤，用自粘型密封膜封闭酶标板，包装于密封袋中，4℃保存3、本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的组成：(1)包被lsaa重组蛋白的酶标板5块；(2)阴性对照血清和阳性对照血清各2ml；(3)酶标抗体，规格为60ml；(4)浓缩洗涤液，规格为200ml；(5)样品稀释液，规格为150ml；(6)显色液a，规格为60ml；(7)显色液b，规格为60ml；(8)终止液，规格为30ml。实施例5：本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒反应条件和阴阳性临界值的界定1、试剂盒elisa反应条件的确定：(1)抗原最佳包被量和待检血清最佳稀释浓度的确定：采用方阵滴定法确定抗原最佳包被量和待检血清最佳稀释浓度。具体操作为：采用方阵滴定法，将lsaa重组蛋白用包被液稀释为2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml，每孔加入100μl，阳性血清和阴性血清分别作1:25、1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释。按照常规elisa方法进行操作，测定od450mm处的吸光度，计算p/n值(p/n值＝阳性血清od450mm/阴性血清od450mm)，选择阳性血清od450mm值接近1，且p/n值最大的孔所对应的抗原包被量和血清稀释度。最终选择抗原量为2μg/ml，血清稀释度为1:200，结果见表1。表1抗原最佳包被量和血清最佳稀释度(2)抗原最佳包被条件的确定：以最佳抗原包被量包被酶标板，分别进行4℃过夜、37℃孵育1h后4℃过夜、37℃孵育2h后4℃过夜三种条件下进行孵育，用已确定的血清稀释度进行间接elisa测定，计算p/n值(p/n值＝阳性血清od450mm/阴性血清od450mm)，选择阳性血清od450mm值接近1，且p/n值最大的孔所对应的条件为最佳包被条件，确定包被条件为：37℃1h后4℃过夜，结果见表2。表2抗原最佳包被时间作用时间4℃过夜37℃1h，4℃过夜37℃2h，4℃过夜阳性血清0.9850.9681.252阴性血清0.1700.1270.197p/n5.7947.6226.355(3)最佳封闭时间的确定：以5％的脱脂奶作为封闭液，在37℃分别封闭1h、1.5h、2h，进行间接elisa测定，根据p/n值(p/n值＝阳性血清od450mm/阴性血清od450mm)，选择阳性血清od450mm值接近1，且p/n值最大的孔所对应的封闭时间为最佳封闭时间，确定最佳封闭时间为37℃，2h，结果见表3。表3最佳封闭条件作用时间37℃1h37℃1.5h37℃2h阳性血清1.0760.9401.101阴性血清0.1330.1290.132p/n8.0907.2868.341(4)一抗最适作用时间的确定：将一抗在37℃分别作用1h、1.5h、2h，进行间接elisa测定，计算p/n值(p/n值＝阳性血清od450mm/阴性血清od450mm)，选择阳性血清od450mm值接近1，且p/n值最大的孔所对应的时间为一抗最适作用时间，确定一抗最适作用时间为37℃，2h，结果见表4。表4一抗最适作用时间作用时间37℃1h37℃1.5h37℃2h阳性血清0.8601.1011.159阴性血清0.1380.1320.124p/n6.2328.3419.347(5)酶标二抗最佳工作浓度的确定：将hrp酶标兔抗猪igg二抗用稀释液分别做1:5000、1:10000、1:20000、1:40000稀释，进行间接elisa测定，根据p/n值(p/n值＝阳性血清od450mm/阴性血清od450mm)，选择阳性血清od450mm值接近1，且p/n值最大的孔所对应的稀释度为二抗最佳工作浓度，确定酶标二抗最佳工作浓度为1:10000稀释，结果见表5。表5酶标二抗最佳工作浓度二抗稀释浓度1:50001:100001:200001:40000阳性血清1.8721.1590.6240.384阴性血清0.1920.1240.1030.090p/n0.7509.2476.0584.267(6)酶标二抗最适作用时间的确定：将酶标二抗在37℃分别作用1h，1.5h，2h，进行间接elisa测定，计算p/n值(p/n值＝阳性血清od450mm/阴性血清od450mm)，选择阳性血清od450mm值接近1，且p/n值最大的孔所对应的时间为二抗最适作用时间，确定酶标二抗最适作用时间为37℃1.5h，结果见表6。表6酶标二抗最适作用时间作用时间37℃1h37℃1.5h37℃2h阳性血清0.6781.1021.781阴性血清0.1280.1070.133p/n5.29610.29913.398(7)显色液(tmb)最适作用时间的确定：以确定的最佳反应条件进行间接elisa测定，加入显色液(tmb)之后，在37℃分别作用10min、15min、20min、25min，加入终止液(2mh2so4)，10min之内在酶标仪上测od450nm处的吸光度，计算p/n值(p/n值＝阳性血清od450mm/阴性血清od450mm)选择阳性血清od450mm值接近1，且p/n值最大的孔所对应的时间为最适显色时间，确定显色液最适作用时间为10min，结果见表7。表7显色液(tmb)最适作用时间显色时间10min15min20min25min阳性血清1.0171.6351.7912.337阴性血清0.1070.1210.1450.147p/n9.50513.51212.35215.8972、阴阳性临值的确定利用上述优化得到的最佳反应条件，采用本发明的猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒对已鉴定为胞内劳森菌抗体阴性的40份血清进行检测，读取od450nm值(结果见表8)，经计算所测40份胞内劳森菌抗体阴性血清的od450nm值的平均值为0.159，其标准差sd值为0.048，根据统计学分析，当样品od450nm值≥0.303时，判定为阳性；当od450nm值≤0.255时，判为阴性，阴性样品检测结果呈正态分布；当od450nm值介于两者之间时，判定为可疑，应进行重复测定。表840份胞内劳森菌抗体阴性血清od450nm值实施例6：本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的操作步骤(1)将待检血清样品用样品稀释液进行200倍稀释，取100μl稀释后的待测血清样品加入到酶标板中，同时设置阳性对照血清和阴性对照血清各两孔，每孔100μl(其中，阳性对照血清和阴性对照血清使用前分别用样品稀释液进行200倍稀释)；轻轻震动，使孔中血清充分混匀，在37℃条件下孵育2h；(2)弃去酶标板孔中的液体，向酶标板孔中加入洗涤液(300μl/l)，重复洗涤3次，每次5min(每次洗涤是都应弃去酶标板孔中液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上排干)；(3)每孔加入100μl酶标抗体，37℃孵育1.5h；(4)弃去酶标板孔中的液体，向酶标板孔中加入洗涤液(300μl/l)，重复洗涤5次，每次5min(每次洗涤是都应弃去酶标板孔中液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上排干)；(5)每孔依次加入显色液a和显色液b各50μl，轻微震荡混匀，室温避光显色10min；(6)每孔加入终止液50μl终止显色，使反应终止；(7)用酶标仪测定od450nm值，并根据od值判定结果。结果判定：当样品od450nm值≥0.303时，判定为阳性；当样品od450nm值≤0.255时，判为阴性，当样品od450nm值介于两者之间时，判定为可疑，应进行重复测定。实施例7：本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的特异性采用本发明实施例4所述的elisa检测试剂盒按照实施例6的操作步骤分别检测大肠杆菌(e.coli)、沙门氏菌(salmonella)、链球菌(streptococcus)、猪流行性腹泻病毒(pedv)和猪传染性胃肠炎病毒(tgev)抗血清，同时设立抗胞内劳森菌阴、阳性血清对照，评价本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的特异性，结果见表9，由表9可知，除抗胞内劳森菌阳性血清外，其余血清的od450nm值均低于0.255，判断为阴性血清，由此表明本发明建立的猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒特异性良好。表9本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的特异性试验血清od450nm值结果tgev0.095-pedv0.099-e.coli0.093-salmonella0.147-streptococcus0.227-l.intracellularis(+)0.933+l.intracellularis(-)0.117-注：“+”表示阳性，“-”表示阴性实施例8：本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的灵敏性将胞内劳森菌的抗血清作1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200倍比稀释后，用本发明实施例4所述的elisa检测试剂盒按照实施例6的操作步骤检测不同稀释浓度抗血清中的特异抗体，每个稀释浓度作3个重复，评价本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的灵敏性，3份血清在1:800时的od450nm值都大于临界值，判定为阳性，表明建立的间接elisa方法有较好的敏感性。结果见表10。表10本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的灵敏性试验实施例9：本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的重复稳定性(1)批内重复用同一批次包被的酶标板对6份血清样品做批内重复实验，每份血清样品做3个平行，其结果如表11所示。由表11可以看出，批内变异系数在0.352％～2.752％，均小于5％，说明该本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒和检测方法具有较好的批内重复性。表11批内重复试验结果(2)批间重复用3个不同批次包被的酶标板对6份血清样品做批间重复实验，每份血清样品做3个平行，其结果如表12所示。由表12可以看出，批间变异系数在0.877％～3.000％，均小于5％，说明该本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒和检测方法具有较好的批间重复性。表12批间重复试验结果实施例10：本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒的临床应用用本发明猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒对河南省不同地区猪场送检的232份来自临床有腹泻症状的病猪的血清样品进行胞内劳森菌抗体检测，初步了解河南省不同地区猪群中胞内劳森菌的感染和流行情况，检测结果如表13所示。由表13可知，232份猪血清样品共有71份显示为胞内劳森菌抗体阳性，阳性率在13.3％～57.1％，平均阳性率为30.6％。表13临床血清样品检测结果血清来源样品数阳性阴性阳性率信阳2442016.7％驻马店3592625.7％南阳56322457.1％周口1521313.3％商丘2031715.0％新乡1851327.7％洛阳2261627.3％平顶山123925.0％郑州3072323.3％合计2327116130.6％虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>河南农业大学<120>一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>232<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metlyslysserilelysglutyrleuileglulysasnlysserasn151015alagluileleuileargserglyglnvallysileasnasngluval202530valphethrproserpheleuilelysaspserasplysileleuile354045gluglnlyslysgluphevalserargglyalatyrlysleuleuala505560alaileglualaphelysleuaspphegluasnlysvalileleuasp65707580ileglyalaserthrglyglypheserglnvalserleuasntyrgly859095alalysleuvaltyralaleuaspvalglyasnasnglnleuasptyr100105110lysleuargglnasnserlysilelysserleugluglnthrasnleu115120125lysserileserlysglnmetphegluvalgluileasplysvalval130135140cysaspvalserpheileserleulysgluvaltyrlysvalvalglu145150155160hisileleulysthrasnaspasptrpilevalleuleulysprogln165170175pheglualaserserlystyrvalglulysglyglyphevalleuglu180185190glnphehispropheleuileaspargserileserglnalaserglu195200205hisasnphelyspheileasplysilethrserproilelysglygln210215220lysserlysasnalaglutyrile225230<210>2<211>702<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>2atgaaaaaaagcattaaagaatacttaattgagaaaaactactccaatgctgaaatttta60attcgttcaggacaagttaaaatcaataatgaagtggtttttactcctagttttttaatt120aaagatagcgataaaatactaattgagcaaaaaaaagaatttgtttctcgtggtgcttat180aaattgctcgccgctattgaagcttttaaactagattttgaaaataaagttattcttgat240atcggtgcatcaacaggtggtttttcacaagttagtttaaattatggagcaaaactagtt300tacgctttagatgttggtaacaatcaactagattacaaattaaggcaaaattcgaaaata360aaatctctagaacaaactaatttaaaatctatttcaaaacaaatgtttgaagttgaaatt420gacaaagtagtttgcgatgtttcatttattagtttaaaagaagtttataaagttgttgag480catattctaaaaactaatgatgattggattgtattattaaagcctcaatttgaagcttct540tcaaaatacgttgaaaaaggtggttttgttttagaacaatttcatccttttttaattgat600cgaagcatatcacaagctagtgaacataattttaaatttattgataaaattacttctcca660attaaaggacaaaaatcaaaaaatgcagaatatattccttga702当前第1页12