一种样品包埋方法与流程

本发明涉及一种样品包埋方法，属于生物技术领域。

背景技术：

代谢物组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后新兴的一门系统学科, 主要研究生物体受外界刺激或扰动后,各种代谢路径的底物或者产物的所有小分子量的代谢产物随时空变化的情况,并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。能够作为生物标志物的重要代谢物的分离鉴定对于理解生物代谢途径具有重要意义。

生物标志物一般是指可供客观测定和评价生物体中在分子、细胞、个体或种群水平上因受疾病，病菌或环境污染物的影响而产生异常变化的信号，它是普通生理或病理的某种特征性的生化指标，通过对生物标志物的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。目前，生物标志物在医学、环境的检测等方面取得了重大进展，有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。目前,代谢组学研究的主要技术手段有液质联用(LC-MS)，核磁共振(NMR)、气质联用(GC-MS)等。这些技术能够实现对样品的非破坏性、样品前处理简单、高通量非选择性分析、较好的重现性等特点，被广泛应用于体液中的代谢组学研究，但此技术需要的研究样品量大、灵敏度低、分辨率不高，使用有一定的局限性。超高液相色谱飞行时间质谱联用(UHPLC-TOF-MS)技术，具有高灵敏度、高分辨率、质量范围宽等特点，而且飞行时间质谱(可以得到更精确的分子质量信息，进而有助于对代谢物的分子结构进行准确分析，UHPLC-TOF-MS 现己经在代谢组学研究中得到了广泛的应用.但是,这些技术不能提供生物组织样品的原位空间信息。

质谱成像(Mass Spectrometry Imaging,MSI)是一种基于质谱分析并将成像处理软件与质谱的离子扫描技术相结合的新型分子成像方法。它能够可视化分析样品区域指定质荷比离子，全面、快速获得被测物的相对含量及分布特征。相对于传统的成像方法，质谱成像具有免荧光标记、不需要复杂样品前处理、可提供丰富的被分析物空间分布信息等优点。因此，质谱成像技术越来越多地受到人们的关注,但研究材料包埋的好坏，是质谱成像能否成功的关键。2014年 Niehoff和2015年Bhandari等分别报道了用龙须胶(tragacanth gum),羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)及琼脂糖(Agarose)等作为包埋物，对果蝇 (双翅目)进行包埋后得到了较好的冷冻超薄切片，但这些包埋物用于同翅目的木虱、褐飞虱包埋，切片易碎，不完整。到目前为止，没有任何关于同翅目昆虫包埋后的质谱成像分析报道。而同翅目昆虫中的木虱是重要经济作物土豆的绿叶病、柑橘的黄龙病的重要传播者，褐飞虱是造成水稻减产的重要害虫，因此，对这些害虫的代谢物的分析，对于从根本上控制这些害虫具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术包埋样品易碎、不完整的缺陷而提供一种新的样品包埋方法，该包埋方法使样品易于切片且切片连续完整。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种样品包埋方法，其包括以下步骤：

(1)将明胶溶液植入已冷却的包埋盒中，填充包埋盒的槽体的一部分空间；每100mL所述明胶溶液中，含有8～15g明胶；

(2)将待包埋的样品放入所述包埋盒中，然后向所述包埋盒中继续植入与步骤(1)完全相同的明胶溶液，直至包埋盒的槽体被充满；

(3)密封包埋盒，然后使包埋盒中的明胶溶液固化，得到包埋了样品的固化包埋物。

明胶溶液中明胶的浓度影响包埋的效果，当每100mL明胶溶液中明胶的质量低于8g时，明胶溶液中溶剂含量太高，在冰冻切片时，样品易碎；当每100mL 明胶溶液中明胶的质量高于15g时，加热后产生较多气泡且气泡不易去除，导致包埋后产生较多的空洞。配制明胶溶液时，将明胶加入溶剂中后，缓慢加热防止气泡产生，直至包埋物完全溶解。

本发明的样品包埋方法以明胶作为包埋物，解决了一些体积小、表皮坚硬且有一层蜡，无法直接置于支持物上冰冻切片的同翅目昆虫样品的包埋问题。本发明所应用的包埋物进行样品包埋后，使得样品，例如同翅目昆虫的冰冻切片变得易切、连续完整且无空洞，具有较大的实际应用价值。本发明的方法简单易行,可高效率地获得较高质量的冰冻切片,并应用于代谢组学的成像分析，技术成本低。本发明的方法尤其可用于体积较小、表层蜡质且坚硬、冷冻易碎的昆虫。

此外，本发明的包埋方法中，明胶溶液是分两次植入包埋盒的，这样可防止样品漂浮于包埋物表面。相较于一次性植入包埋物而言，分两次植入明胶溶液可调整样品包埋的位置，例如将样品包埋在包埋物的正中间，这些都是一次性植入无法实现的。分两次植入明胶溶液时，所述步骤(2)中，待步骤(1) 已植入明胶溶液的包埋盒四周有凝结迹象但未凝结之时，再将需要包埋的样品放入，样品植入后，要快速植入另一部分明胶溶液，防止两次植入的明胶分层。

需说明的是，上述步骤(1)中，明胶溶液填充包埋盒的槽体的一部分空间占槽体全部空间的比例大于0低于100％即可，这一部分空间可根据样品在明胶中待包埋的位置确定，例如，待将样品包埋在明胶正中间，步骤(1)可选择将明胶溶液填充包埋盒的槽体的一半空间。

作为本发明所述样品包埋方法的优选实施方式，每100mL所述明胶溶液中，含有10g明胶。采用该浓度的明胶溶液时，即使在明胶溶解不充分时，切出的切片仍然透明。

作为本发明所述样品包埋方法的优选实施方式，所述明胶溶液为明胶水溶液。

作为本发明所述样品包埋方法的优选实施方式，所述明胶溶液中的明胶为深海鱼明胶或猪皮明胶。

作为本发明所述样品包埋方法的优选实施方式，所述步骤(1)和步骤(2) 中，明胶溶液的温度均为45～55℃。作为本发明所述样品包埋方法的更优选实施方式，所述步骤(1)和步骤(2)中，明胶溶液的温度均为50℃。为使明胶溶液的温度为45～55℃，可将配制好的明胶溶液置于45～55℃水浴中保温。

作为本发明所述样品包埋方法的优选实施方式，所述样品为同翅目昆虫。作为本发明所述样品包埋方法的更优选实施方式，所述样品为木虱或褐飞虱。本发明的样品尤其适用于体型较小、表层有蜡质且坚硬表皮的同翅目昆虫，优选为木虱或褐飞虱。

作为本发明所述样品包埋方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，将明胶溶液植入已冷却的包埋盒中，填充包埋盒的槽体的一半空间；所述已冷却的包埋盒的温度为0～8℃。冷却包埋盒可避免融化的包埋物植入包埋盒后使包埋盒变形。包埋盒可置于冰箱中进行冷却，对于1cm×2cm的包埋盒，通常冷却需要 10～15min，当然根据不同的包埋盒及其大小可自主调整冷却时间。

作为本发明所述样品包埋方法的优选实施方式，所述包埋盒为蜡质纸包埋盒或聚乙烯包埋盒。本发明不限于所述包埋盒，还可以选用本领域常用的其它材料。包埋盒的选材是非常广泛的，只要是不透水，能够密封且不易变形就可以。

作为本发明所述样品包埋方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，明胶溶液于常温下固化1～2小时。

本发明按照上述方法制备的固化包埋物保存温度为-20℃，保存时间为4-5 天。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的样品包埋方法以明胶作为包埋物，解决了一些体积小、表皮坚硬且有一层蜡，无法直接置于支持物上冰冻切片的同翅目昆虫样品的包埋问题。现有技术的包埋物，如石蜡、树脂等包埋样品会严重影响质谱分析，其他已报道的包埋物如琼脂糖包埋样品后，在切片时样品易碎，难以获得完整的组织切片。本发明所应用的包埋物进行样品包埋后，使得样品，例如同翅目昆虫的冰冻切片变得易切、连续完整且无空洞，具有较大的实际应用价值。本发明的方法简单易行,可高效率地获得较高质量的冰冻切片,并应用于代谢组学的成像分析，技术成本低。本发明的方法尤其可用于体积较小、表层蜡质且坚硬、冷冻易碎的昆虫。

附图说明

图1为本发明实施例1固化包埋物冰冻切片的电子显微镜图；

图2为图1中方框所示木虱的放大图；

图3为本发明实施例1固化包埋物采用DHB处理后的电子显微镜图；

图4为本发明实施例6树脂包埋木虱后冰冻切片的电子显微镜图；

图5为本发明实施例1固化包埋物的质谱成像分析结果图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中，深海鱼明胶，购买自Sigma公司，货号为G7041-100g；猪皮明胶，购买自Sigma公司，货号为G1890。

实施例1

本发明样品包埋方法的一种实施例，本实施例所述样品包埋方法为：

(1)将1cm×2cm的包埋盒置于4℃冰箱中10分钟，使包埋盒完全冷却，即已冷却的包埋盒的温度为4℃；其中，所述包埋盒为蜡质纸包埋盒；

(2)将深海鱼明胶加入双蒸水中，缓慢加热，直至深海鱼明胶完全溶解，得到深海鱼明胶水溶液，将深海鱼明胶水溶液置于50℃的水浴中保温，使其温度为50℃；所述深海鱼明胶水溶液中，深海鱼明胶的质量百分比为10％；

(3)从包埋盒入口将步骤(2)制得的温度为50℃的深海鱼明胶水溶液植入步骤(1)已冷却的包埋盒中，填充包埋盒的槽体的一半空间；

(4)待包埋盒四周有凝结迹象但未凝结之时，将待包埋的样品放入所述包埋盒中，端正位置；然后迅速向所述包埋盒中继续植入步骤(2)制得的温度为 50℃的深海鱼明胶水溶液，直至包埋盒的槽体被充满；其中，所述样品为木虱；

(5)将样品和深海鱼明胶水溶液植入口部分的盖体和槽体密封，静置，使包埋盒中的深海鱼明胶溶液固化；

(6)拆除所述盖体、槽体，得到包埋了木虱的固化包埋物。

实施例2

本发明样品包埋方法的一种实施例，本实施例所述样品包埋方法为：

(1)将1cm×2cm的包埋盒置于4℃冰箱中10分钟，使包埋盒完全冷却，即已冷却的包埋盒的温度为4℃；所述包埋盒为聚乙烯包埋盒；

(2)将深海鱼明胶加入双蒸水中，缓慢加热，直至深海鱼明胶完全溶解，得到深海鱼明胶水溶液，将深海鱼明胶水溶液置于50℃的水浴中保温，使其温度为50℃；所述深海鱼明胶水溶液中，深海鱼明胶的质量百分比为10％；

(3)从包埋盒入口将步骤(2)制得的温度为50℃的深海鱼明胶水溶液植入步骤(1)已冷却的包埋盒中，填充包埋盒的槽体的一半空间；

(4)待包埋盒四周有凝结迹象但未凝结之时，将待包埋的样品放入所述包埋盒中，端正位置；然后迅速向所述包埋盒中继续植入步骤(2)制得的温度为 50℃的深海鱼明胶水溶液，直至包埋盒的槽体被充满；其中，所述样品为褐飞虱；

(5)将样品和深海鱼明胶水溶液植入口部分的盖体和槽体密封，静置，使包埋盒中的深海鱼明胶溶液固化；

(6)拆除所述盖体、槽体，得到包埋了样品的固化包埋物。

实施例3

本发明样品包埋方法的一种实施例，本实施例所述样品包埋方法为：

(1)将包埋盒置于0℃冰箱中15分钟，使包埋盒完全冷却，即已冷却的包埋盒的温度为0℃；所述包埋盒为聚乙烯包埋盒；

(2)将猪皮明胶加入双蒸水中，缓慢加热，直至猪皮明胶完全溶解，得到猪皮明胶水溶液，将猪皮明胶水溶液置于45℃的水浴中保温，使其温度为45℃；所述猪皮明胶水溶液中，猪皮明胶的质量百分比为8％；

(3)从包埋盒入口将步骤(2)制得的温度为45℃的猪皮明胶水溶液植入步骤(1)已冷却的包埋盒中，填充包埋盒的槽体的一半空间；

(4)待包埋盒四周有凝结迹象但未凝结之时，将待包埋的样品放入所述包埋盒中，端正位置；然后迅速向所述包埋盒中继续植入步骤(2)制得的温度为 45℃的猪皮明胶水溶液，直至包埋盒的槽体被充满；其中，所述样品为褐飞虱；

(5)将样品和猪皮明胶水溶液植入口部分的盖体和槽体密封，静置，使包埋盒中的猪皮明胶溶液固化；

(6)拆除所述盖体、槽体，得到包埋了样品的固化包埋物。

实施例4

本发明样品包埋方法的一种实施例，本实施例所述样品包埋方法为：

(1)将包埋盒置于8℃冰箱中8分钟，使包埋盒完全冷却，即已冷却的包埋盒的温度为8℃；所述包埋盒为聚乙烯包埋盒；

(2)将猪皮明胶加入双蒸水中，缓慢加热，直至猪皮明胶完全溶解，得到猪皮明胶水溶液，将猪皮明胶水溶液置于55℃的水浴中保温，使其温度为55℃；所述猪皮明胶水溶液中，猪皮明胶的质量百分比为15％；

(3)从包埋盒入口将步骤(2)制得的温度为55℃的猪皮明胶水溶液植入步骤(1)已冷却的包埋盒中，填充包埋盒的槽体的三分之一空间；

(4)待包埋盒四周有凝结迹象但未凝结之时，将待包埋的样品放入所述包埋盒中，端正位置；然后迅速向所述包埋盒中继续植入步骤(2)制得的温度为 55℃的猪皮明胶水溶液，直至包埋盒的槽体被充满；其中，所述样品为木虱；

(5)将样品和猪皮明胶水溶液植入口部分的盖体和槽体密封，静置，使包埋盒中的猪皮明胶溶液固化；

(6)拆除所述盖体、槽体，得到包埋了样品的固化包埋物。

实施例5

将实施例1制得的包埋了木虱的固化包埋物冰冻切片(切片的厚度为 15μm)，然后贴在载玻片上，采用电子显微镜进行观察，结果如图1和图2所示。由图1和图2可见，木虱的轮廓清晰，完整。

申请人还采用DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid；2,5-二羟基苯甲酸)处理实施例1制得的包埋了木虱的固化包埋物，DHB处理的具体方法为：将阳离子基质2,5-DHB溶于甲醇，得到浓度为20mg/mL的DHB甲醇溶液，通过自动喷雾机(参数为80Bar)将DHB甲醇溶液均匀喷射在包埋物冰冻切片的表面，常温干燥1h。处理后，采用电子显微镜观察冰冻切片，结果如图3所示。由图3可见，采用明胶包埋木虱不会影响DHB介质的均匀分布。

申请人进一步采用质谱成像分析了实施例1制得的包埋了木虱的固化包埋物，结果如图5所示。从图5可以清晰的分辨出不同代谢物的分布情形，以及在不同虫体重中的差异分布。可见，明胶包埋不会影响代谢物的成像分析。

将实施例2～4制得的包埋物采用DHB处理前后分别采用电子显微镜进行观察，发现样品的轮廓均清晰，完整；采用质谱成像分析实施例2～4制得的包埋物，均可以清晰的分辨出不同代谢物的分布情形，以及在不同虫体重中的差异分布，在此不一一赘述。

实施例6

本实施例中，申请人采用树脂包埋木虱，包埋的方法除包埋物外，其他均与实施例1相同。将树脂包埋的木虱冰冻切片(切片的厚度为15μm)，然后贴在载玻片上，采用电子显微镜进行观察，结果如图4所示。由图4可以明显看到，在昆虫切片周围，树脂包埋物不透明，会影响接下来的DHB覆盖效果。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。