本发明涉及生化检验和体外诊断领域。本发明还涉及药物生产过程的质量控制。具体而言，本发明涉及测定肝素活性的试剂盒及其制备方法。
背景技术：
肝素是由二种多糖交替连接而成的多聚体，无论在体内还是体外，均具有很强的抗凝作用，临床上把它作为抗凝剂药物而广泛使用，主要用于血栓性疾病的治疗及心血管手术、血液透析、体外循环等过程的抗凝处理。
肝素作为药物，其活性功能的精准检测无论对于生产过程的质量控制还是临床治疗中患者的动态监控均具有重要的意义。作为生物活性物质，其检测不能单单用化学或物理的方法，必须与生物检测法结合，目前肝素的活性测定多采用凝固法和发色底物法。凝固法操作繁琐，耗时费力，精准性很差。相对于凝固法，发色底物法具有灵敏度高，操作简便的特点且检测范围更广。
凝固法原理：该试验是基于普通肝素(高度负电荷的分子)被硫酸鱼精蛋白(正电荷的蛋白)中和的原理。配备不同浓度的硫酸鱼精蛋白加入血浆中，再加入凝血酶，测量凝固时间。将凝血酶凝固时间恢复至正常的硫酸鱼精蛋白浓度就被认为是肝素的浓度，这个过程仅仅用于普通肝素。
发色底物法原理：Xa因子(factor Xa,FXa)是一种丝氨酸蛋白酶，位于血液凝集级联的上游，处在连接内源性和外源性激活途径共同通路的中心位置，Xa因子抑制剂既能阻断内源性凝血亦能抑制外源性凝血的发生。发色底物法利用待测样品中的肝素与抗凝血酶III(antithrombin III,AT III)形成复合物，促进抗凝血酶III与过量添加的Xa因子的特异性结合，抑制Xa因子活性中心，使其失去活性。剩余的Xa因子与发色底物作用，释放出显色基团pNA而显色，其颜色深浅与肝素活性成反比。
利用发色底物法的原理产生了一些肝素活性测定方法。例如，专利CN103063592A公开了一种肝素活性的测定方法，建立了一种较高精准性的肝素活性测定方法，该专利主要提高了试剂灵敏度及准确性。
然而上述传统测定方法仍然存在试剂稳定性，尤其是热稳定性较低的问题，本领域亟需一种具有改进的热稳定性的肝素活性测定试剂盒，以更好地适应于临床药物动态监测及生产过程控制等用途。
技术实现要素：
在一个方面，本发明提供了一种肝素活性测定试剂盒，其包含试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包含发色底物及缓冲液，所述试剂R2包含甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠、Xa因子(Fxa)及缓冲液。
在一些实施方案中，试剂R1中所述发色底物选自如下一项或多项：Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA、Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg-pNA·HCl、N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl、和Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl。在一个优选的实施方案中，所述发色底物为Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl。最优选地，所述发色底物的浓度为0.1～3.0g/L。
在一些实施方案中，试剂R2中甘氨酸浓度为10.0～50g/L。在一些实施方案中，试剂R2中乳酸锂浓度为1.0～5.0g/L。在一些实施方案中，试剂R2中谷氨酸钠浓度为30.0～100.0g/L。在一个优选的实施方案中，试剂R2中Xa因子的浓度为0.05～3.0U/ml。在本发明的上下文中，活性单位U指的是在特定的条件下，1min能转化1μmol底物的酶量，即1U＝1μmol/min。
在一些实施方案中，试剂R1中的缓冲液选自HEPES、Tris和磷酸盐缓冲液的一种或多种，优选为HEPES。在一些实施方案中，试剂R2中的缓冲液选自HEPES、Tris和磷酸盐缓冲液的一种或多种，优选为Tris。在一个优选的实施方案中，试剂R1中的缓冲液浓度为10～50g/L，且/或R2中的缓冲液浓度为10～50g/L。
在本发明的一些实施方案中，试剂R1进一步包含表面活性剂。在一些优选实施方案中，试剂R1中的表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚和聚氧乙烯烷基醚。更优选地，试剂R1中的聚氧乙烯十二烷基醚的浓度为0.5～10.0ml/L，聚氧乙烯烷基醚的浓度为0.5～10.0ml/L。
在一些实施方案中，试剂R1进一步包含稳定剂、无机盐、防腐剂、和还原剂。在一些实施方案中，试剂R1中的稳定剂可以是甘露醇、山梨醇、和聚乙二醇中的一种或多种，且优选为甘露醇。在一个优选实施方案中，试剂R1中的稳定剂浓度为5.0～100.0g/L。在一些实施方案中，试剂R1中的无机盐可以是钠盐或钾盐，例如NaCl或KCl，优选为NaCl。更优选地，试剂R1中的无机盐离子浓度为1.0～30.0g/L。在一些实施方案中，试剂R1中的防腐剂可以是PC300(指防腐剂ProClin300，其主要包含2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、MIT(指2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、和叠氮化钠的一种或多种；优选为叠氮化钠。优选地，所述防腐剂浓度为0.1～10g/L。在一些实施方案中，所述还原剂可以是羟胺化合物，例如盐酸羟胺、硫酸羟胺、正丁醛、酒石酸、抗坏血酸和甲酸中的任一种或多种，优选为盐酸羟胺。更优选地，试剂R1中所述还原剂浓度为1.0～50g/L。
在一些实施方案中，试剂R2进一步包含无机盐和表面活性剂。在进一步的实施方案中，试剂R2中的无机盐可以是钠盐或钾盐，例如NaCl或KCl，优选为NaCl。更优选地，所述无机盐浓度为1.0～30.0g/L。在一些的实施方案中，试剂R2中的表面活性剂可以是Tween-20。优选地，试剂R2中的表面活性剂浓度为0.5ml～5.0ml。
在一些实施方案中，试剂R2进一步包含抗凝剂和防腐剂。在进一步的实施方案中，所述抗凝剂可以是除肝素外的其他抗凝剂，例如EDTA·2Na、EDTA·2K、柠檬酸钠等，优选为EDTA·2Na。在进一步的实施方案中，试剂R2中的防腐剂可以是PC300、MIT、和叠氮化钠的一种或多种；优选为叠氮化钠。优选地，试剂R2中所述抗凝剂浓度为1.0～50.0g/L，防腐剂浓度为0.1～10g/L。
在一些实施方案中，R2中的甘氨酸、乳酸锂和谷氨酸钠共同用作稳定剂。在一些实施方案中，所述肝素为普通肝素或低分子肝素。优选地，所述试剂盒中R1与试剂R2的体积比为1:1。
在一些实施方案中，本发明的肝素活性测定试剂盒包含试剂R1和试剂R2，其各自包含如下组分：
在一些实施方案中，所述肝素为普通肝素或低分子肝素。
在本发明的又一个方面，提供了一种测定肝素活性的方法，例如在药物生产过程中测定肝素活性的方法，其包括如下步骤：
(a)提供待测样品及前述任一实施方案所述的肝素活性测定试剂盒；
(b)将所述样品与试剂盒中的试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
(c)测定反应后的吸光度差值；
(d)根据吸光度变化值计算样品中的肝素的活性。
在一些实施方案中，步骤(b)中所述的试剂R1与试剂R2的混合体积比为1:1。在进一步的实施方案中，步骤(b)中所述的样品与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比为1:20至1:50。在一些实施方案中，所述肝素为普通肝素或低分子肝素。
在本发明的又一个方面，提供了将甘氨酸、乳酸锂和谷氨酸钠的组合用于提高肝素测定试剂稳定性的用途。
在本发明的又一个方面，提供了甘氨酸、乳酸锂和谷氨酸钠的组合在制备用于测定Xa特异性抑制剂的试剂中的用途。优选地，提供了前述任一实施方案所述的试剂盒用于测定Xa特异性抑制剂的用途。在一些实施方案中，所述Xa特异性抑制剂选自下组：利伐沙班、阿哌沙班、和依度沙班。
除另有说明外，本文对试剂R1中的组分浓度限定，应理解为该组分在试剂R1中所占的浓度；同理，本文对试剂R2中的组分浓度限定，应理解为该组分在试剂R2中所占的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明发现在试剂R1中添加还原剂(例如盐酸羟胺)及聚氧乙烯烷基醚能够提升其抗血红蛋白干扰效果，而聚氧乙烯十二烷基醚能够提升其抗乳糜干扰效果，而稳定剂(例如甘露醇、山梨醇、或聚乙二醇)的作用下可有效提升发色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl的稳定性；
(2)本发明在试剂R2中添加稳定剂甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠，能够有效稳定Xa因子的效价，令人惊奇地发现该三种组分具有协同效应，使本发明具有比常规肝素测定试剂盒显著更高的稳定性。
此外，本试剂盒除了可测定普通肝素及低分子肝素外，还可用于测定Xa特异性抑制药物。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1.本发明试剂盒与现有试剂盒的稳定性效果对比
为了检验本发明试剂盒的稳定性效果，将本发明的试剂盒与不含甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠的常规试剂盒进行了对比，其具体步骤如下。
(1)本发明试剂盒(设为对照组)的制备：
表1.本发明试剂盒配方
现有试剂盒(设为实验组0)的制备见下表：
(2)稳定性测试
将上述对照组及实验组0进行37℃热稳定验证，具体步骤如下：
实验仪器：STA-R全自动凝血分析仪
质控血浆：STAGO普通肝素质控品
实验步骤：
②将对照组及实验组试剂配置好后分装；
②再分别对STAGO普通肝素质控品测定肝素活性初始值后(即0天测定值)，置于37℃水浴放置；
③将37℃热破坏一定时间后的试剂取出，分别再对STAGO普通肝素质控品测定肝素活性；
④将放置后的测定平均值与初始测定平均值(即0天测定值)计算相对偏差(即变化率)。相对偏差在±10％以内视为稳定。
(3)结果及分析：质控水平1和2分别代表两个不同肝素活性的样本，水平1代表高值，水平2代表低值，每个水平进行3次重复试验取均值，单位为U/mL。
表2.对照组及实验组0的稳定性结果
结论：由表2可见，本发明试剂盒在热破坏后第0-14天内对质控品测量结果稳定，相对偏差极地；而对照试剂盒从第7天开始相对偏差维持在10％以上，说明本发明的试剂盒与现有技术相比具有显著提高的热稳定性。
实施例2.甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠对于稳定Xa因子的协同效应研究
在本实施例中，对于本发明试剂盒中R2添加的稳定剂组分甘氨酸、乳酸锂、和谷氨酸钠之间对于稳定Xa因子的协同效应进行了验证。
(1)试剂盒制备：对照组试剂盒制备如表1所示；实验组1-3的试剂盒制备如表3所示(即分别缺少了甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠)。
表3.实验组1-3试剂盒配方
(2)稳定性测试
将实验组1-3进行37℃热稳定验证，具体步骤如实施例1中所述。
(3)结果及分析：质控水平1和2分别代表两个不同肝素活性的样本，水平1代表高值，水平2代表低值，每个水平进行3次重复试验取均值，单位为U/mL。对照组稳定性结果见上表1，实验组1-3稳定性结果见下表4。
表4.实验组1-3的稳定性结果
可见，实验组1-3中Xa因子在14天的范围内均呈现不同程度的不稳定，说明本发明试剂盒中R2的组分甘氨酸、乳酸锂、和谷氨酸钠之间在抵抗热破坏的效果上存在协同作用，能够显著提高试剂对Xa因子的稳定性，效果远优于缺少三者中任一组分的试剂配方。
实施例3.甘氨酸对于稳定Xa因子的重要性研究
在本实施例中，对于本发明的试剂R2中的组分甘氨酸的重要性进行了探索。
(1)试剂盒制备：按照下表5所述配制实验组4-8的检测试剂盒。对照组试剂盒与实施例1中对照组相同。
表5.采用不同氨基酸的试剂盒配方
(2)稳定性测试
将实验组4-8进行37℃热稳定验证，具体步骤与实施例1相同。
(3)结果及分析
表6.实验组4-8的稳定性结果
结论：如表6显示，将R2中的甘氨酸替换为精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、谷氨酸、或丙氨酸均在14天内出现不同程度的相对偏差超过10％。可见，采用其他氨基酸无法达到本发明的显著稳定性，甘氨酸组分对于本发明发现的稳定剂协同作用是必要的。
实施例4.谷氨酸钠对于稳定Xa因子的重要性研究
在本实施例中，对于本发明的试剂R2中的组分谷氨酸钠的重要性进行了探索。
(1)试剂盒制备：按照下表7配制实验组9的检测试剂盒。对照组试剂盒与实施例1中对照组相同。
表7.采用其他谷氨酸盐代替谷氨酸钠的试剂盒配方
(2)稳定性测试
将实验组9进行37℃热稳定验证，具体步骤与实施例1相同。
(3)结果及分析
表8.实验组9的稳定性结果
结论：如表6显示，将R2中的谷氨酸替换为谷氨酸钾，其在14天内出现相对偏差明显高于对照组，并在低14天时超过10％。证明在R2中采用其他谷氨酸盐的试剂稳定性显著低于采用谷氨酸钠的试剂。
实施例5.乳酸锂对于稳定Xa因子的重要性研究
在本实施例中，对于本发明的试剂R2中的组分乳酸锂的重要性进行了探索。
(1)试剂盒制备：按照下表9所述配制实验组10的检测试剂盒。对照组试剂盒与实施例1中对照组相同。
表9.采用乳酸钙代替乳酸锂的试剂盒配方
(2)稳定性测试
将实验组10进行37℃热稳定验证，具体步骤与实施例1相同。
(3)结果及分析
表10.实验组10的测定结果
结论：由于添加乳酸钙后，检测过程中会出现纤维蛋白沉淀，导致检测结果会不准确及报错。R2中添加乳酸锂是发明人经大量实验探索得出达到本发明的显著稳定性所必要的组分。
实施例6.各稳定剂(甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠)的用量筛选
在本实施例中，对试剂R2中各稳定剂(甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠)的用量进行了浓度梯度实验，并检测其在30天内的检测稳定性，以探索三种稳定剂的适用浓度范围。
试剂盒制备：实验组11-25中试剂盒R2组分如下表10所示，除表10中标注浓度的梯度测试组分外，R1和R2中其余组分浓度与表1相同。对照组试剂盒组分与实施例1中表1相同。
热稳定性测试步骤与实施例1相同。
不同浓度的稳定剂测试结果：详见下表10和11
表10.R2中三种稳定剂组分的浓度梯度稳定性结果概述
表11.三种稳定剂组分的浓度梯度详细结果
由实验结果得出，试剂R2中三种稳定剂的最适浓度范围分别为：甘氨酸10.0～50g/L，乳酸锂1.0～5.0g/L，以及谷氨酸钠30.0～100.0g/L。
实施例7.试剂盒其他组分的用量筛选
在本实施例中，通过实验26-67对试剂盒中的多个组分用量浓度范围进行了检验，以探索各种组分的浓度范围。
试剂盒制备：实验组26-67中试剂盒的组分如下表12所示，除表12中标注浓度的测试组分外，R1和R2中其余组分浓度与表1相同。对照组试剂盒组分与实施例1中表1相同。
热稳定性测试步骤与实施例1相同。
不同浓度的各组分适用浓度梯度实验：在热处理后第1、7和30天分别检验质控品1、2的活性单位测定结果与第0天的相对偏差，结果详见下表12
表12
通过上述实验，得出了本发明试剂盒的适用浓度范围。
实施例7.对试剂R1、R2中可选组分的探索
本实施例对试剂R1、R2中的一些可选组分及其浓度进行了测试，具体为R1中的缓冲液由HEPES酸替换为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液；R2中的缓冲液由Tris替换为HEPES酸、磷酸盐缓冲液。以及将R1、R2中的无机盐氯化钠替换为氯化钾、硫酸钠。
实验方法及步骤与前述实施例相同，实验结果如下表13中实验所示：
表13
由上表可见，替换可选组分后，同样能达到本发明的稳定性效果
应该理解到，本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可在不悖离本发明主旨的情况下变化。还应理解本文所述的实施例仅仅是出于描述具体实施方案的目的，而非意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求限定。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。