本发明涉及一种从精液中分离提纯外泌体的方法。
背景技术：
差速离心是目前用于分离细胞上清或体液来源的外泌体最常见技术之一，该方法包括以下几个步骤：低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片；高速离心以消除大囊泡；高速离心以沉淀外泌体。来源于beckman公司的外泌体提取流程如图1所示。
生物体液的粘度与分离的外泌体的纯度有显著的相关性，而且，高粘度的生物样本需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。但是，更长的的超速离心步骤容易损耗外泌体的总量，更高的离心速度容易破坏外泌体的正常形态。而常规的外泌体提取流程则无法得到纯度符合要求的外泌体。因此，对于粘度较高的生物体液，比如精液，现有的外泌体分离方法不能很好的满足相关实验要求，目前迫切需要一种即能保质又能保量的外泌体分离提纯方法。
技术实现要素：
针对精液等粘度较高的生物体液，现有的外泌体分离方法提取时精液来源外泌体时出现的总量耗损和纯度不高的技术问题，本发明提供了一种从精液中分离提纯外泌体的方法，通过该方法可以获得质量较高且纯度更加符合实验要求的精液来源外泌体。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种从精液中分离提纯外泌体的方法，包括以下步骤：
(1)采用pbs对精液样本进行稀释；此步是为了使精液原液中粘稠成分得到初步稀释，尽量避免外泌体被带入下一步离心的细胞沉淀中，减少外泌体的损失。
(2)将步骤(1)中稀释后的精液样本，在4℃条件下以4000g的转速离心，留取上清液，弃沉淀；以去除细胞和死细胞。
(3)将步骤(2)得到的上清液在4℃条件下以12000g的转速离心，留取上清液，弃沉淀；以去除死碎片。
(4)将步骤(3)得到的上清液用pbs稀释；以尽量减少外泌体被粘性物质附着而使其纯度降低。
(5)将步骤(4)稀释后的上清液用0.22μm滤器过滤处理；以去除较大直径杂质颗粒。
(6)将步骤(5)得到的上清液与peg6000充分混合，使peg6000终浓度为8wt％，再4℃过夜；
(7)4℃过夜后，将步骤(6)得到的混合物在4℃条件下以12000g的转速离心，留取沉淀，弃上清；以浓缩、提纯精液来源外泌体。
(8)将步骤(7)得到的沉淀用pbs重悬，在4℃条件下以100000g的转速离心；离心结束后，弃上清，留取沉淀，以去除大囊泡；再将沉淀用pbs重悬，4℃条件下放置；
(9)将步骤(8)得到的重悬液在4℃条件下以100000g的转速离心；离心结束后，弃上清，留取沉淀，该沉淀即为分离提纯所得的精液来源外泌体。
优选地，所述步骤(1)中pbs与精液样本的体积比为3:1。
优选地，所述步骤(2)中离心时间为15分钟。
优选地，所述步骤(3)中离心时间为30分钟。
优选地，所述步骤(4)中pbs与上清液的体积比为9:1。
优选地，所述步骤(6)中peg6000是含有160g/lpeg6000和58.44g/lnacl的水溶液。
优选地，所述步骤(7)中离心时间为30分钟。
优选地，所述步骤(8)中离心时间为70分钟，放置时间为1小时。
优选地，所述步骤(9)中离心时间为70分钟。
本发明提供了一种采用上述方法分离提纯的外泌体。
本发明的有益效果在于：本发明与常规的外泌体分离提取方法相比，
1、删减300g、2000g的低转速离心步骤，尽量避免外泌体被粘性物质带入下一步离心的细胞沉淀中，减少外泌体的损失。
2、采用两步稀释法，减少了外泌体的损耗，提高了其纯度。
3、采用8％peg6000过夜处理，使外泌体纯度得到进一步提升。
4、所使用pbs均采用0.1μm滤器过滤处理，减少了外来杂质的带入。
5、采取两步过滤法(0.22μm滤器过滤处理)，减少了较大粒径颗粒混入。
综上所述，采用本发明方法，在对精液来源外泌体保质保量的前提下，最大限度的提高了其纯度。
附图说明
图1为来源于beckman公司的外泌体提取流程；
图2为本发明从精液中分离提纯外泌体的方法的流程图；
图3为精浆外泌体超速离心比较；
图4为精浆外泌体蛋白浓度比较；
图5为精浆外泌体电镜比较。
具体实施方式
本发明方法与常规的外泌体分离提取方法相比，仍沿用差速离心的方法，但针对精液粘度较高的特性，进行了一系列改良，如图2所示，主要分为9步：
第1步：精液样本以体积比为1:3的比例，用pbs(0.1μm滤器过滤处理)稀释。此步是为了使精液原液中粘稠成分得到初步稀释，尽量避免外泌体被带入下一步离心的细胞沉淀中，减少外泌体的损失。经过试验，当精液样本与pbs的体积比大于1:3时，达不到稀释的效果；当精液样本与pbs的体积比小于1:3时，容易造成精液的浪费，另外会导致后续工作量剧增。
第2步：稀释后的精液样本，在4℃条件下以4000g的转速离心15分钟，留取样本上清液，弃沉淀，以去除细胞和死细胞。
第3步：将样本上清液在4℃条件下以12000g的转速离心30分钟，留取样本上清液，弃沉淀，以去除死碎片。
第4步：将样本上清液再以体积比为1:9的比例用pbs(0.1μm滤器过滤处理)进一步稀释，以尽量减少外泌体被粘性物质附着而使其纯度降低。经过试验，发现当样本上清液与pbs的体积比大于1:9时，太浓了，达不到稀释的效果；当精液样本与pbs的体积比小于1:9时，会导致后续工作量剧增，不太适合大规模应用普及。发现样本上清液与pbs的体积比为1：9比例稀释，效果最好，并且最合适的，因为稀释后可以1管50ml离心管装下，大大减少工作量。
第5步：将稀释后的样本上清液用0.22μm滤器过滤处理，以去除较大直径杂质颗粒。
第6步：将过滤后的样本上清液与2×的peg6000(由16gpeg6000，5.844gnacl溶于100mlddh2o配制)按体积比为1：1的比例充分混合，使peg6000终浓度为8wt％，再4℃过夜。
第7步：4℃过夜后，将混合液在4℃条件下以12000g的转速离心30分钟，留取沉淀，弃上清，以浓缩、提纯精液来源外泌体。
第8步：将沉淀用pbs(0.1μm滤器过滤处理)重悬，在4℃条件下以
100000g的转速离心70分钟。离心结束后，弃上清，留取沉淀，以去除大囊泡。再将沉淀用pbs(0.1μm滤器过滤处理)重悬，4℃条件下放置1小时。
第9步：在4℃条件下以100000g的转速离心70分钟。离心结束后，弃上清，留取沉淀，沉淀即为分离提纯所得的精液来源外泌体。
采用常规外泌体分离方法和本发明方法从精液中提取外泌体，数据均由同一个体同一次相同体积的精液原液所得。通过比较常规外泌体分离方法和本发明方法在精液来源外泌体超离速心后直观图(如图3所示)、所得外泌体粒径、bca法测得外泌体总蛋白量(如图4所示)以及外泌体电镜(如图5所示)，力证本发明方法切实可行，效果显著。从图3可以看出，精液来源外泌体超离速心后直观上，提纯处理后其颜色较常规处理稍深，提示外泌体获取量更多。进一步通过bca法验证，检测两种不同处理下外泌体总蛋白的量，从图4可以看出，提纯处理后所得外泌体总蛋白量较常规处理更多。最后通过电镜对所得外泌体进行最直观的检测，从图5可以看出提纯处理后，所得外泌体较常规处理纯度明显提升，外泌体形态规则整齐，轮廓清晰可见，未见明显的杂质粘附。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。