本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，用于鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)抗体的快速检测。
背景技术：
鸭病毒性肝炎是危害雏鸭的一种急性、高致死性传染病，具有发病急、病程短、传播快、病死率高等特点，主要侵害3周龄以内雏鸭，严重威胁养鸭业健康发展。该病的病原为鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)，由于DHAV序列之间存在显著差异，且不同型的DHAV间无交叉反应，又将DHAV分为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。迄今为止，国内流行的主要为DHAV-1和DHAV-3毒株，除台湾外，内陆尚未见DHAV-2毒株的报道。流行病学研究结果显示，近年来DHAV-3的感染有明显增加趋势，其危害越来越严重。随着DHAV-3疫苗的问世，如何评价该疫苗的免疫效果已迫在眉睫。
目前DHAV抗体的检测主要依赖传统的血清中和试验，但该方法存在检测周期长，费时费力的缺陷，不利于批量样品的快速检测；并且基于全病毒建立的ELISA方法因DHAV纯化比较困难而限制了该方法的推广应用。VP1基因编码主要的抗原位点并具有主要的型特异性中和位点，是决定病毒抗原性的主要成分。利用基因工程技术研制的针对DHAV-3的ELISA抗体检测试剂盒已有报道，但该试剂盒是选用完整的VP1蛋白作为包被抗原，该蛋白表面存在较多的抗原表位，可能或多或少存在非特异性干扰现象。而合成的特异性抗原表位多肽其抗原特异性高，是最理想的ELISA检测抗体的包被抗原，可实现DHAV-3抗体的高通量检测，为鸭甲肝病毒3型的综合防控提供技术支撑。
技术实现要素：
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种鸭甲肝病毒3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，以实现鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)抗体的快速检测。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，包括以DHAV-3型合成多肽W7包被的ELISA板；所述合成多肽W7包括如N-SRNHRPFRFCLRLKT-CooH所示的氨基酸序列结构。
所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，所述合成多肽W7的氨基酸序列结构为N-SRNHRPFRFCLRLKT-CooH。
所述合成多肽W7包被的ELISA板的制备方法为：用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液作包被液，将所述合成多肽W7稀释至浓度为1μg/mL，按100μL/孔剂量加入至ELISA反应板中，于37℃下作用2小时，并于4℃包被过夜，拍干后用Porcine skin Gelatin于37℃封闭2小时，以pH7.4、含浓度0.05％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干并待其干燥后装入含干燥剂的包装袋保存，备用。
所述试剂盒还包括样品稀释液、10×浓缩洗涤液、酶结合物工作液、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照。
所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：
所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒：
所述样品稀释液为含浓度0.05％吐温-20的0.01M的磷酸盐缓冲液，pH7.4；
所述10×浓缩洗液为含浓度0.5％吐温-20的0.1M的磷酸盐缓冲液，pH7.4；
所述酶结合物工作液为HRP-羊抗鸭IgG；
所述显色液为体积比1：1的浓度0.2mg/mL四甲基联苯胺(TMB)溶液和含浓度0.5‰过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液的混合液；
所述终止液为浓度0.31％氢氟酸溶液；
所述阳性对照为经筛选获得的DHAV-3阳性血清，其OD650nm≥1.0，并加入1000U/mL的青链霉素；
所述阴性对照为经筛选获得的阴性血清，其OD650nm≤0.25，并加入1000U/mL的青链霉素。
本发明还公开了所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，包括将待检血清加入至所述合成多肽W7包被的ELISA板的步骤。
所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，具体包括：将待检血清用所述样品稀释液按1：100比例进行稀释，随后按100μL/孔剂量加入至所述ELISA板中，同时设阴性对照及阳性对照，于37℃孵育45min；反应结束后，弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μL，洗涤3-5次，每次间隔1min，拍干；随后每孔加100μL所述酶结合物工作液，于37℃孵育45min；随后加洗涤液洗涤3-5次，每次间隔1min，拍干；并依次加入100μL显色液，于37℃避光孵育15min，并加50μL终止液终止反应，用酶标仪在650nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。
本发明还公开了所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒在DHAV-3抗体的检测领域中的应用。
本发明还公开了一种快速检测DHAV-3抗体的方法，包括以所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒对待测血清进行检测的步骤；其检测样本的判定标准为：当待检样本OD650nm值与阴性对照OD650nm值的比值(P/N)大于或等于2.1，且待检样本OD650nm值大于0.280判为阳性。
本发明所述鸭甲肝病毒3型多肽间接ELISA检测试剂盒，以合成的多肽W7为包被抗原，其对于DHAV-3抗体的特异性高，安全性好，且不含无关杂蛋白，只与DHAV-3阳性血清特异结合，不与其它病毒的阳性血清发生交叉反应，具有良好的抗原性，使得本发明所述检测试剂盒具有很高的特异性和敏感性。
本发明所述鸭甲肝病毒3型多肽间接ELISA检测试剂盒，可对DHAV-3抗体水平作出评价，该试剂盒操作简便、快速，适合批量样品的检测，大大提高了鸭肝炎血清学诊断的速度。
具体实施方式
实施例1合成多肽W7的特异性验证
本实施例所述合成多肽W7的氨基酸序列结构为N-SRNHRPFRFCLRLKT-CooH，其合成可以按照本领域技术人员所熟知的多肽合成的方法进行，如多肽的固相合成等方法予以合成。
将合成的多肽W7用碳酸盐缓冲液分别稀释至蛋白浓度为1μg/mL，每孔100μL包被，放湿盒37℃作用1h后4℃过夜，弃去液体，以PBST洗涤3次，拍干；随后加入封闭液Porcine skin Gelatin，控制剂量300μL/孔，于37℃封闭2h；弃去液体，加PBST洗涤3次；用样品稀释液将鸡阳性血清(DHAV-3)和SPF鸡阴性血清分别作1：100稀释，控制剂量100μL/孔，于37℃作用1h；弃去液体，以PBST洗涤3次；加入羊抗鸡的二抗，控制剂量100μL/孔，37℃作用30min；弃去液体，PBST洗涤3次；加底物(TMB)，控制剂量100μL/孔，避光作用15min；加入终止液，控制剂量50μL/孔，放酶标仪读数。
表1多肽的特异性验证
上表1所示结果表明，所述合成多肽W7只能与DHAV-3阳性血清发生特异性反应，而与DHAV-1无交叉反应。
实施例2试剂盒成分配制
所述样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液：取KH2PO40.2g，NaHPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000mL，再加0.5mL吐温-20；
所述10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液：取KH2PO42g，NaHPO4·12H2O 29g，NaCl 80g，定容至1000mL，再加5mL吐温-20；
所述终止液为0.31％氢氟酸溶液：取氢氟酸0.31ml，双蒸水定容至100mL；
阳性对照：将制备的阳性血清用所述样品稀释液作1：100稀释(其OD650nm≥1.0)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤，作为试剂盒的阳性对照；
阴性对照：将筛选获得的阴性血清(OD650nm≤0.25)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤，作为试剂盒的阴性对照。
所述显色液配制：称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用100mL无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000mL；称取21g柠檬酸(C6H8O7·H2O)，28.2g无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)，6.4mL 0.75％过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000mL，调pH值4.5-5.0；控制二者的体积比为1：1。
实施例3间接ELISA反应条件的确定
本实施例采用方阵试验确定多肽抗原和血清最佳工作浓度。用包被缓冲液将所述合成多肽W7作1：10，1：20，1：40，1：80等系列稀释，包被ELISA反应板，控制剂量100μL/孔；抗DHAV-1和DHAV-3的阳性血清和阴性血清用样品稀释液分别作1：50，1：100，1：200，1：400系列稀释；进行间接ELISA测定；加入显色液显色，及终止液终止反应；并测定光波长650nm的OD值，结果如表2所示。
取阳性血清OD650nm1.0左右，阴性血清OD650nm0.25左右，且阳性血清OD650nm/阴性血清OD650nm即P/N值大于2.1的抗原浓度和血清稀释度为最佳工作浓度，结果表明血清最佳稀释度为1：100，多肽最佳包被浓度1.0μg/mL。
表2多肽抗原和血清最佳工作浓度的确定(OD650nm值)
将收集的30份无DHAV-1和DHAV-3抗体的鸭血清，在最佳工作条件下进行间接ELISA测定，以确定鸭血清在无DHAV-1和DHAV-3感染时其吸收值范围因此，确定以待检样本OD650nm值与阴性OD650nm值的比值(P/N)大于或等于2.1，且待检样本OD650nm值大于0.280判为阳性。
实施例4鸭甲肝病毒3型多肽间接ELISA抗体检测反应板的制备
用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液作包被液，将鸭甲肝病毒3型合成多肽W7稀释为1μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反应板中，37℃作用2小时，4℃包被过夜，拍干，用Porcine skin Gelatin37℃封闭2小时，以含0.05％吐温-20pH7.4的PBS洗涤，拍干，待其干燥后装入含干燥剂的包装袋中保存，备用。
实施例5 ELISA抗体检测试剂盒
本实施例所述鸭甲肝病毒3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，包括以下组分：
实施例4制备的ELISA板条(96孔)：5块；
实施例2配制的10×浓缩洗涤液：400mL(用前1：10稀释)；
实施例2配制的样品稀释液：400mL；
酶结合物工作液：羊抗鸭酶标二抗(美国KPL公司)，100mL；
实施例2配制的显色液：200mL；
实施例2配制的终止液：100mL；
实施例2配制的阳性血清对照(+)：2mL；
实施例2配制的阴性血清对照(-)：2mL。
本实施例所述ELISA抗体检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)将待检血清用样品稀释液作1：100稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性血清对照、阳性血清对照，37℃孵育45min；
(2)弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液(PBST)350μL，洗涤3-5次，每次间隔1min，拍干；
(3)每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育45min；
(4)重复上述步骤(2)；
(5)加入100μL显色液，37℃避光孵育15min；
(6)加50μL终止液，用酶标仪在650nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。
实施例6特异性试验
交叉试验：用鸭甲肝病毒3型多肽W7建立的间接ELISA检测试剂盒分别检测鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型等阳性血清及阴性血清、鸭瘟、鸭呼肠孤病毒病、鸭新城疫、鸭流感，每样本4个重复，进行交叉反应性测定，检测结果显示鸭甲肝病毒3型阳性血清为阳性结果，其余均为阴性，表明该检测试剂盒与鸭甲肝病毒1型、鸭瘟、鸭呼肠孤病毒病、鸭新城疫及鸭流感等无交叉反应。
阻抑试验：将DHAV-3阳性血清分别与等体积的DHAV-1(200TCID50/0.2ml)和DHAV-3(200TCID50/0.2ml)以及鸭瘟病毒(200TCID50/0.2ml)混合，室温作用30min，将处理后的血清与未作任何处理的血清分别按最佳反应条件进行阻抑试验测定，结果表明DHAV-3阳性血清只能被DHAV-3特异性阻抑，不能被DHAV-1和鸭瘟病毒阻抑。
实施例7敏感性试验
将DHAV-1(中和效价1：186)和DHAV-3阳性血清(中和效价1：166)分别作1：50-1：6400稀释，其余条件按最佳反应条件进行ELISA检测。结果表明，DHAV-1和DHAV-3阳性血清稀释到1:1600时，其OD650nm仍高于临界值0.278(如表3所示)，表明该ELISA检测试剂盒具有较高的敏感性。
表3敏感性试验
实施例8重复性试验
分别用两次包被的酶标板，检测5份DHAV-3阳性血清和5份阴性血清，每个样品重复检测5次，测定其变异系数CV％(CV＝S.D./X×100％，S.D.：标准差，X：算术平均值)。结果表明变异系数最大为3.27％，最小为1.19％。10份血清变异系数都较小，具有较好的重复性。
实施例9临床应用
临床应用检验的样品为试验样品和部分送检样品。采用血清中和试验和鸭甲肝病毒3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒同时进行检测，比较两种方法的符合率，结果如表4所示。
表4 ELISA检测试剂盒与中和试验比较
注：检出符合率＝(共同阳性数+共同阴性数)/总样品数×100％
从表4数据可知，中和试验检出DHAV-3阳性血清10份，阳性检出率为33.3％，ELISA检测试剂盒检出DHAV-3阳性血清为11份，阳性检出率为36.7％，两种方法的符合率为96.7％。可见，本发明所述ELISA检测试剂盒适宜于临床应用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。