本发明属于生物技术领域，涉及寄生虫电镜样品制备技术领域，具体涉及一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备设备及方法。
背景技术：
寄生原生动物，又称原虫，是营寄生生活的一大类原生动物。它们个体非常微小，整个虫体都由单个细胞构成，因此是最原始、最低等的真核生物；其细胞内有特化的各种胞器，具有维持生命和延续后代所必需的全部生理功能，如运动、摄食、消化、呼吸、排泄和生殖等，因此每个寄生原生动物又都是一个完整的有机体，是最全能的细胞。寄生原生动物种类繁多，迄今为此已发现近万种。它们通常寄生于动物或人类的体表、细胞、组织或腔道内，可造成宿主的一系列损伤，并引发各种疾病，如疟原虫、利什曼原虫、弓形虫、隐孢子虫等。
肠道寄生原生动物是指主要寄生于宿主消化系统内的原虫，其中的一些种类，如结肠小袋纤毛虫、痢疾阿米巴等，能引起宿主严重腹泻，造成粘膜的破坏和脱落；在一定条件下，并可扩延至肝、肺、脑、泌尿生殖系统和其他部位，形成溃疡和脓肿。另外，由于它们对肠壁组织的破坏，还常引起继发性的细菌病、病毒病等，对宿主造成严重危害。
在制定寄生虫病的防治方案前，必须对寄生虫的种类作出准确的诊断，才能采取正确、合理的措施，对症下药。而当前寄生虫检测最主要的手段仍然是形态学观察，这是最简单、最直接、最迅速的方法。同时，形态学观察也是寄生虫学研究的基础和热点。光学显微镜是进行寄生虫形态学观测最常用的设备。然而，由于寄生原虫个体非常微小，仅依靠光学显微镜通常很难对其形态特征进行精确的观测和虫种鉴定。随着科技的进步和发展，扫描电子显微镜观察已成为研究寄生原生动物形态结构较为先进和常用的手段；其对虫体各部位的精细构造具有很高的分辨率，进行虫种鉴定更加准确可靠，在很大程度上弥补了利用光学显微镜进行形态学观测的不足。
就目前而言，由于宿主肠道内容物较多，寄生原虫的个体又非常微小，肉眼不可见，常规的扫描电镜样品制备过程中对样品的清洗、脱水和置换过程极易造成虫体的丢失，且非常浪费时间和试剂，最后的结果也无法预期。因此非常有必要对肠道寄生原生动物扫描电镜样品的制备设备、方法和过程进行改进和优化，以达到快速、优质制备其扫描电镜样品的目的。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备设备及方法。该设备包括自制小滤器，能够方便地进行组装和拆卸；该方法能够高效、优质地制备肠道寄生原生动物扫描电镜样品，同时避免样品的丢失、节约药品成本并防止因使用锇酸对人体造成损害。
为此，本发明采用了以下技术方案：
一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备设备，包括自制小滤器；所述自制小滤器包括内套管、外套管和滤膜，所述内外两个套管和滤膜嵌合在一起，能够组装和拆卸。
优选地，所述内套管的长度大于外套管，内套管的两端均伸出外套管一定的长度；所述滤膜嵌合在内外两个套管相同的一端之间，并完整包裹住内套管的端口。
优选地，还包括ep管，ep管的一端为封闭的圆锥形，另一端为开口的圆柱形，所述自制小滤器通过圆柱形开口端嵌入到ep管中。
进一步地，所述ep管的开口端还设有用于封闭管子的盖子，所述盖子通过固定的带子与ep管连接在一起。
进一步地，所述ep管的容量为1.5ml；所述内套管的长为36mm，内直径为5mm，外直径为6mm；所述外套管的长为26mm，内直径为6mm，外直径为8mm；所述滤膜为直径为25mm的圆形，孔径可根据虫体的大小进行选择。
一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备方法，包括以下步骤：
步骤一，样品收集与清洗：将寄生原生动物从肠道中挑取出来置于0.65％生理盐水中，静置10min；收集虫体，转移至新的生理盐水滴中，连续清洗3次，每次10min；
步骤二，样品固定与清洗：将步骤一中清洗干净的虫体置于2.5％戊二醛中固定2-4h，然后将固定好的虫体置于自制小滤器中，放入装有pbs缓冲液的ep管中清洗样品3次，每次10min，以彻底除去戊二醛；
步骤三，样品脱水与置换：将装有虫体的自制小滤器依次进行梯度酒精脱水，每次5min；然后进行乙酸异戊酯梯度置换，每次5min；然后将虫体从自制小滤器的滤膜上取出置于100％醋酸异戊酯中，放置10min；
步骤四，样品干燥与镀膜：将虫体置于用多聚赖氨酸处理过的特制玻片上，并用眉毛笔调整虫体体位，以适应不同部位的观察需求；然后用临界点干燥仪进行干燥，用离子溅射仪镀膜，完成扫描电镜样品的制备。
优选地，步骤三中所述依次进行梯度酒精脱水包括30％，50％，70％，90％，95％，100％，100％。
优选地，步骤三中所述乙酸异戊酯梯度置换包括无水乙醇、醋酸异戊酯1:1溶液1次，100％醋酸异戊酯1次。
优选地，步骤四中所述特制玻片的尺寸大小为1cm×1cm。
优选地，对制备所得的扫描电镜样品，采用扫描电镜进行观察，用以判断样品的质量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)自制小滤器极大的提高了样品固定后序步骤(清洗、脱水、置换)的工作效率，同时避免了样品的丢失。
(2)样品固定步骤中省略了锇酸后固定，但并不影响固定效果，这样就简化了步骤、节约了药品费用并防止了因使用锇酸对人体造成损害。
(3)用经过多聚赖氨酸处理的特制玻片承载样品并对样品体位进行调整有助于得到全方位、高质量的图片，能更加逼真的展示虫体的原始形态特征。
附图说明
图1是本发明所提供的一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备设备的实体图。
图2是本发明所提供的一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备设备的结构组成示意图。
图3是本发明所提供的一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备设备中内外套管的结构示意图。
图4是本发明所提供的一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备设备中滤膜的结构示意图。
图5是本发明实施例一所提供的一种湖北拟肠肾虫扫描电镜图片(标尺bar＝50μm)。
图6是本发明实施例二所提供的一种扇形蛙片虫扫描电镜图片(标尺bar＝100μm)。
图7是本发明实施例三所提供的一种华鲮肠袋虫扫描电镜图片(标尺bar＝100μm)。
附图标记说明：1、内套管；2、外套管；3、滤膜；4、ep管。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，其中的具体实施例以及说明仅用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
如图1和图2所示，本发明公开了一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备设备，包括自制小滤器；所述自制小滤器包括内套管1、外套管2和滤膜3，所述内外两个套管和滤膜嵌合在一起，能够组装和拆卸。
具体地，如图2所示，所述内套管1的长度大于外套管2，内套管1的两端均伸出外套管2一定的长度；所述滤膜3嵌合在内外两个套管相同的一端之间，并完整包裹住内套管1的端口。
具体地，如图3所示，还包括ep管4，ep管4的一端为封闭的圆锥形，另一端为开口的圆柱形，所述自制小滤器通过圆柱形开口端嵌入到ep管4中。
具体地，所述ep管4的开口端还设有用于封闭管子的盖子，所述盖子通过固定的带子与ep管4连接在一起。
具体地，所述ep管4的容量为1.5ml；所述内套管1的长为36mm，内直径为5mm，外直径为6mm；所述外套管2的长为26mm，内直径为6mm，外直径为8mm；所述滤膜3为直径为25mm的圆形，如图3和4所示。
实施例一
这里以湖北拟肠肾虫为例，介绍一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备方法，包括以下步骤：
(1)样品收集与清洗：将湖北拟肠肾虫从黑斑蛙肠道中挑取出来置于0.65％生理盐水中，静置10min；收集虫体，转移至新的生理盐水滴中，连续清洗3次，每次10min。
(2)样品固定与清洗：将清洗干净的虫体置于2.5％戊二醛中固定2h，然后将固定好的虫体置于自制小滤器中，用pbs缓冲液清洗3次，每次10min。
(3)样品脱水与置换：将装有虫体的自制小滤器依次进行梯度酒精脱水(30％，50％，70％，90％，95％，100％，100％)，每次5min；而后进行乙酸异戊酯梯度置换(无水乙醇：醋酸异戊酯1:1溶液1次；100％醋酸异戊酯1次)，每次5min；然后将虫体从自制小滤器的滤膜上取出置于100％醋酸异戊酯中，放置10min。
(4)样品干燥与镀膜：将虫体置于用多聚赖氨酸处理过的特制玻片上(1cm×1cm)，并用眉毛笔调整虫体体位，以适应不同部位的观察需求；而后用临界点干燥仪进行干燥，用离子溅射仪镀膜，完成扫描电镜样品的制备。
(5)针对本实施例制备所得的湖北肠肾虫扫描电镜样品，用扫描电镜quanta200(fei，holand)观察。
本实施例制成的湖北拟肠肾虫样品用扫描电镜观察的形态如图5所示，从图5可以看出虫体的原始形态特征得到了非常逼真的展示。利用承载玻片上多聚赖氨酸的粘性对样品体位进行调整，非常有助于得到虫体全方位、高质量的图片。另外，步骤中省去了锇酸后固定，但虫体的形态效果并没有受到任何影响。
实施例二
这里以扇形蛙片虫为例，介绍一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备方法，包括以下步骤：
(1)样品收集与清洗：将扇形蛙片虫从黑眶蟾蜍肠道中挑取出来置于0.65％生理盐水中，静置10min；收集虫体，转移至新的生理盐水滴中，连续清洗3次，每次10min。
(2)样品固定与清洗：将清洗干净的虫体置于2.5％戊二醛中固定2h，然后将固定好的虫体置于自制小滤器中，用pbs缓冲液清洗3次，每次10min。
(3)样品脱水与置换：将装有虫体的自制小滤器依次进行梯度酒精脱水(30％，50％，70％，90％，95％，100％，100％)，每次5min；而后进行乙酸异戊酯梯度置换(无水乙醇：醋酸异戊酯1:1溶液1次；100％醋酸异戊酯1次)，每次5min；然后将虫体从自制小滤器的滤膜上取出置于100％醋酸异戊酯中，放置10min。
(4)样品干燥与镀膜：将虫体置于用多聚赖氨酸处理过的特制玻片上(1cm×1cm)，并用眉毛笔调整虫体体位，以适应不同部位的观察需求；而后用临界点干燥仪进行干燥，用离子溅射仪镀膜，完成扫描电镜样品的制备。
(5)针对本实施例制备所得的扇形蛙片虫扫描电镜样品，用扫描电镜quanta200(fei，holand)观察。
本实施例制成的扇形蛙片虫样品用扫描电镜观察的形态如图6所示，从图6可以看出虫体的原始形态特征得到了非常逼真的展示。利用承载玻片上多聚赖氨酸的粘性对样品体位进行调整，非常有助于得到虫体全方位、高质量的图片。另外，步骤中省去了锇酸后固定，但虫体的形态效果并没有受到任何影响。
实施例三
这里以华鲮肠袋虫为例，介绍一种肠道寄生原生动物扫描电镜样品的快速制备方法，包括以下步骤：
(1)样品收集与清洗：将华鲮肠袋虫从鲮鱼肠道中挑取出来置于0.65％生理盐水中，静置10min；收集虫体，转移至新的生理盐水滴中，连续清洗3次，每次10min。
(2)样品固定与清洗：将清洗干净的虫体置于2.5％戊二醛中固定2h，然后将固定好的虫体置于自制小滤器中，用pbs缓冲液清洗3次，每次10min。
(3)样品脱水与置换：将装有虫体的自制小滤器依次进行梯度酒精脱水(30％，50％，70％，90％，95％，100％，100％)，每次5min；而后进行乙酸异戊酯梯度置换(无水乙醇：醋酸异戊酯1:1溶液1次；100％醋酸异戊酯1次)，每次5min；然后将虫体从自制小滤器的滤膜上取出置于100％醋酸异戊酯中，放置10min。
(4)样品干燥与镀膜：将虫体置于用多聚赖氨酸处理过的特制玻片上(1cm×1cm)，并用眉毛笔调整虫体体位，以适应不同部位的观察需求；而后用临界点干燥仪进行干燥，用离子溅射仪镀膜，完成扫描电镜样品的制备。
(5)针对本实施例制备所得的华鲮肠袋虫扫描电镜样品，用扫描电镜quanta200(fei，holand)观察。
本实施例制成的华鲮肠袋虫样品用扫描电镜观察的形态如图7所示，从图7可以看出虫体的原始形态特征得到了非常逼真的展示。利用承载玻片上多聚赖氨酸的粘性对样品体位进行调整，非常有助于得到虫体全方位、高质量的图片。另外，步骤中省去了锇酸后固定，但虫体的形态效果并没有受到任何影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围之内所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。