本发明涉及肥料领域，特别涉及一种检测微生物肥料固氮效果的方法。
背景技术
微生物肥料中固氮微生物主要有固氮菌属、氮单孢菌属、拜耶林克氏菌属和德克斯氏菌属等细菌，杆状、卵圆形或球形，革兰氏染色阴性。这些固氮细菌具严格好氧性，能固定空气中的氮素，以分子态氮为氮素营养，将其还原为nh3。固氮菌中的固氮酶除能将分子氮还原为氨外，还能催化一些具有n—n、n＝o、c≡n以及c≡c键化合物的还原，如将乙炔(c2h2)还原为甲烷(ch4)等。
含固氮细菌的功能微生物肥料、生物有机肥、固氮菌肥的质量指标应包括固氮菌的含量和固氮效果。目前我国微生物肥料、生物有机肥和菌肥的质量指标中仅规定了所含菌体的种类和数量，如丰田宝生物有机肥中的有效活菌数≥0.2亿/g芽孢杆菌，其中含固氮芽孢杆菌0.1亿/g，其他为解磷菌、解钾菌和拮抗菌。虽然将芽孢杆菌定为质量指标，因不同芽孢杆菌在功能上差异很大，尤其固氮功能又是体现微生物肥料效果的核心指标，所以不同产品的应用效果往往差异很大。但国标中对其产品中固氮菌的数量、固氮效果和其他功能却没有附带要求，使含优质高效的固氮菌肥在现代农业和节能减排中的作用不能充分发挥。为促进功能生物有机肥、固氮菌肥和微生物肥料的健康发展，充分发挥固氮菌在替代化肥中的作用，为土壤生态改良、节能减排和绿色食品生产做出更大贡献，急需建立功能微生物肥料、生物有机肥、固氮菌肥固氮效果的检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于创造一种检测微生物肥料固氮效果的方法，可准确评价功能生物有机肥、固氮菌肥和微生物肥料的固氮效果。
基于上述目的，本发明提供的一种检测微生物肥料固氮效果的方法，测定方法为：称取生物有机肥(或固氮菌肥、微生物肥料)100g，放于250ml的具塞三角瓶中，加入150ml无菌水浸泡4h，用漏斗过滤，将过滤后的清液用冷冻离心机离心，取沉淀(菌体)放于-80℃超低温冰箱中保存。以液体发酵的天然固氮菌解淀粉芽孢杆菌作对照，取发酵液10克，经冷冻离心机离心，取沉淀。
将对照和从肥料中提取的菌株分别接种到装有改良型半固体培养基的输液瓶中，反应体系中固氮细菌的浓度为0.01亿/ml，用透气滤菌封口膜封口，28℃培养72小时，用高纯氮气分别冲洗15s、30s和60s，以比较不同微氧状态下的酶活性。准确充入10ml高纯乙炔气体培养8小时，取气体样品60ul，立即加入2mlsds中止反应。用气相色谱仪测定气体样品中的乙烯产量。测定条件为：活性al2o3填充柱(3mm×2m)，氢焰检测器，柱温70℃，h2压力60kpa，n2压力70kpa，空气压力50kpa，检测器温度150℃，进样口温度150℃。乙炔和乙烯保留时间分别为3.142min和0.792min，氧气的保留时间为0.337min。数据采集和输出使用气相色谱仪配套的处理机系统。将已经中止反应的培养物100℃下加热5min，使半固体培养物液化，测定培养物中菌体蛋白含量。每个处理重复3次。固氮酶活性按毫克菌体蛋白每小时形成的乙烯量表示。
通过测定相同天然固氮菌量的固氮酶活性，根据检测样品中固氮酶活性与天然固氮菌对照相比的活性提高倍数，评价其固氮效果。用以判别含固氮菌的生物有机肥、固氮菌肥和微生物肥料的固氮效果。判别肥料中固氮菌固氮效果的标准为：处理与相同菌量的天然固氮解淀粉芽孢杆菌相比，其固氮酶活性相近，固氮能力提高≦10倍，替代化肥中氮素的能力低于10％，固氮效果较低，表明该肥料中的菌源为低水平固氮菌(普通固氮菌)。处理与相同菌量的天然固氮解淀粉芽孢杆菌相比，其固氮酶活性提高1～2倍，固氮能力提高10～20倍，替代化肥中氮素的能力达10％～30％，固氮效果明显，表明该产品中的菌源为中等水平固氮菌(有效固氮菌)。处理与相同菌量的天然固氮解淀粉芽孢杆菌相比，其固氮酶活性提高2～3倍，固氮能力提高20～30倍，替代化肥中氮素的能力达30％～50％，固氮效果显著，表明该产品中的菌源为较高水平固氮菌(中效固氮菌)。处理与相同菌量的天然固氮解淀粉芽孢杆菌相比，其固氮酶活性提高3～4倍，固氮能力提高30～40倍，替代化肥中氮素的能力达50％～70％，固氮效果较高，表明该产品中的菌源为高水平固氮菌(高效固氮菌)。处理与相同菌量的天然固氮解淀粉芽孢杆菌相比，其固氮酶活性提高4～5倍，固氮能力提高50倍以上，替代化肥中氮素的能力达100％，固氮效果很高，表明该产品中的菌源为超高水平固氮菌(超级固氮菌)。
可选的，测定固氮酶活性方法可为乙炔还原法，用气相色谱仪检测。还可用氰化物还原法、氧化亚氮还原法、联氨还原法、叠氮化物还原法等代替乙炔还原法。
可选的，测定固氮酶活性方法，也可采用凯氏定氮法、水杨酸分光光度法、纳氏试剂分光光度法、蒸馏—中和滴定法等，检测固氮反应体系中氨的生成量。
可选的，含固氮菌的肥料可为生物有机肥、微生物肥料、固氮菌肥。
可选的，含固氮菌的肥料的物理状态可为固体和液体。
可选的，对照菌株可为天然固氮解淀粉芽孢杆菌、固氮菌属细菌、氮单孢菌属细菌、拜耶林克氏菌属细菌和德克斯氏菌属细菌中的单一菌株，应与肥料中检测的固氮菌株相同。
可选的，反应体系中固氮细菌的浓度为0.001～0.04亿/ml，且以0.01亿/ml为最佳，但菌源不同其反应体系中的细菌浓度也不限于此。
本发明还提供一种检测微生物肥料固氮效果的方法，不仅可检测生物有机肥、微生物肥料、固氮菌肥的固氮效果，还可用于鉴定从土壤中分离的固氮菌、及其定向强化选育固氮菌的固氮效果。也可用于检测固氮菌长期存放后其固氮效果的稳定性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实例10.2亿/g芽孢杆菌丰田宝生物有机肥固氮效果测定
称取丰田宝生物有机肥100g，放于250ml的具塞三角瓶中，加入150ml无菌水浸泡4h，用漏斗过滤，将过滤后的清液用冷冻离心机离心，取沉淀(菌体)放于-80℃超低温冰箱中保存。以液体发酵的天然固氮菌解淀粉芽孢杆菌作对照。采用乙炔还原法测定相同天然固氮菌量的固氮酶活性，用以判别0.2亿/g芽孢杆菌丰田宝生物有机肥固氮效果。
实例20.2亿/g芽孢杆菌生物有机肥固氮效果测定
称取0.2亿/g芽孢杆菌生物有机肥100g，放于250ml的具塞三角瓶中，加入150ml无菌水浸泡4h，用漏斗过滤，将过滤后的清液用冷冻离心机离心，取沉淀(菌体)放于-80℃超低温冰箱中保存。以液体发酵的天然固氮菌解淀粉芽孢杆菌作对照。采用乙炔还原法测定相同天然固氮菌量的固氮酶活性，用以判别0.2亿/g芽孢杆菌生物有机肥固氮效果测定。
实例3微生物肥料的固氮效果测定
称取微生物肥料100g，放于250ml的具塞三角瓶中，加入150ml无菌水浸泡4h，用漏斗过滤，将过滤后的清液用冷冻离心机离心，取沉淀(菌体)放于-80℃超低温冰箱中保存。以液体发酵的天然固氮菌解淀粉芽孢杆菌作对照。采用乙炔还原法测定相同天然固氮菌量的固氮酶活性，用以判别微生物肥料的固氮效果。
实例4固氮菌肥的固氮效果测定
称取固氮菌肥100g，放于250ml的具塞三角瓶中，加入150ml无菌水浸泡4h，用漏斗过滤，将过滤后的清液用冷冻离心机离心，取沉淀(菌体)放于-80℃超低温冰箱中保存。以液体发酵的天然固氮菌解淀粉芽孢杆菌作对照。采用乙炔还原法测定相同天然固氮菌量的固氮酶活性，用以判别固氮菌肥的固氮效果。
本发明采用乙炔还原法，测得不同来源的样品固氮菌浓度为0.02亿/ml时，不同菌源的固氮酶活性见表1，从表1看出，从0.2亿/g芽孢杆菌丰田宝生物有机肥中提取的固氮菌固氮酶活性是天然固氮菌的4.5倍，选育固氮菌原菌的固氮酶活性是天然固氮菌的4.7倍，丰田宝生物有机肥中所含固氮菌来源于选育固氮菌。也说明天然固氮菌固氮活性较低，经选育诱变，菌源固氮能力稳定后，其固氮酶活性才能显著提高，固氮能力才会剧增，成为高效或超高效固氮菌，这样的固氮菌才真正具有开发应用价值。
表10.2亿/g芽孢杆菌丰田宝生物有机肥的固氮酶活性
*表中数据经新复极差法统计，含相同字母者为差异不显著(反应体系中的固氮菌浓度均为0.02亿/ml)
本发明涉及生物有机肥中的微生物种类主要为芽孢杆菌等细菌类，还可替换为放线菌类、真菌类、固氮蓝藻等。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。