一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法与流程

本发明涉及分析检测
技术领域：
，特别涉及一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法。
背景技术：
香菇(lentinusedodes(berk.)sing.)属于担子菌纲伞形科真菌，是世界名贵药食两用菌。香菇多糖(lentinan，lnt)是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，临床与药理研究表明，lnt具有明显的免疫调节功能，通过激活机体免疫系统发挥抗肿瘤、抗病毒等多种药理活性，已是现代研究的热点所在。lnt的生物学活性与其主链结构、空间构型等因素密切相关。lnt的化学结构为每5个β-(1,3)-吡喃葡萄糖苷相连为线性主链，侧链连有2个β-(1,6)-d-吡喃葡萄糖苷分支的β-(1,3)-d-葡聚糖。适度分子量的lnt在水溶液中由于氢键作用，可形成稳定的三螺旋构型。研究发现只有含三螺旋结构的lnt才具有明显的抗肿瘤活性。目前针对lnt中三螺旋结构的检测方法主要有三类：1)酶法。酶法是国际上最常用的检测方法，但步骤繁琐，不同酶种及比例对测定结果影响较大，且高活性的专一酶价格较贵；2)蛋白特异识别法。蛋白特异识别法常用鲎g因子实验法和dectin-1检测法，同样存在步骤繁琐、价格昂贵等问题，应用有限；3)无机化学法，如苯酚-硫酸法。无机化学法只能检测多糖中总糖含量，对三螺旋结构没有专属性。专利cn107132149a公开了一种快速特异性检测凝胶多糖含量的方法，但是lnt具有特有的三螺旋结构，其无法和一般的多糖检测方法通用，容易被其他多糖干扰检测。因此，目前尚缺乏对lnt中三螺旋结构的快速、特异、高灵敏检测的分析方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法，使得所述检测方法具有较高的专属性、准确性和灵敏度，同时具备较宽的线性范围。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法，包括：步骤1、配制不同浓度三螺旋结构香菇多糖标准品溶液，加入苯胺蓝工作液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液避光反应，在激发波长370-430nm，发射波长460-550nm条件下，测定△f，以△f和三螺旋结构香菇多糖标准品溶液浓度为坐标轴，建立标准曲线；步骤2、将待测样品加入苯胺蓝工作液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液避光反应，在激发波长370-430nm，发射波长460-550nm条件下，测定△f，根据所述标准曲线获得待测样品中三螺旋结构香菇多糖的含量。针对目前缺少监测三螺旋结构香菇多糖的有效方法的问题，本发明将苯胺蓝和荧光法结合，以苯胺蓝荧光法进行检测，同时优化检测方法各项参数，使得所述检测方法专属性、准确性和灵敏度均较高。作为优选，所述激发波长为390-420nm，在本发明具体实施方式中，所述激发波长为394nm、404nm或414nm；所述发射波长为470-530nm，在本发明具体实施方式中，所述发射波长为472nm、482nm、492nm、502nm、512nm或522nm。作为优选，所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液为ph值为7-12、0.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，其中所述ph值可以具体为7、8、9、10、11或12。作为优选，所述△f为(f-f0)/f0，其中f表示实验组荧光强度，即标准品或待测样品溶液反应后荧光强度，f0表示空白对照组荧光强度，即苯胺蓝工作液自身荧光强度。作为优选，所述苯胺蓝工作液中苯胺蓝的质量百分比为0.05-3.2％；在本发明具体实施方式中，该质量百分比为0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％或3.2％。作为优选，所述避光反应的温度为40-90℃；在本发明具体实施方式中，所述温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或90℃。作为优选，所述避光反应的时间为大于等于15min；具体地，可以是15-50min，如15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min或50min。在对本发明所述检测方法的方法学考察试验中，本发明表现出较高的精密度、准确度、稳定性以及极佳的灵敏度；其中，平行6次测定最终浓度为20μg/ml香菇多糖标准品溶液的△f，其rsd为0.93％；0、2、4、6、8、10和12h时测定香菇多糖标准品溶液的△f，其rsd为0.41％；加样回收率在99.20％-102.80％之间，平均回收率为100.65％，rsd为1.53％，证明本发明检测方法测定香菇多糖的准确度高；在检测限lod的检测中，本发明检测方法能够检测到最小浓度为0.5μg/ml，表现出极为优秀的灵敏度。此外，在检测方法专属性的考察实验中，添加50倍浓度以内的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维素、淀粉、黄原胶、党参多糖和木聚糖对荧光测定均无影响，说明该方法专属性良好。由以上技术方案可知，本发明将苯胺蓝和荧光法结合，在反应阶段采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液作为反应介质，在特定激发波长和发射波长下进行检测，同时优化检测方法各项参数，使得所述检测方法专属性、准确性和灵敏度均较高。附图说明图1所示不同激发波长和发射波长下对本发明检测方法△f的影响结果；其中，ex.表示激发波长，em.表示发射波长；图2所示不同苯胺蓝工作液浓度对本发明检测方法△f的影响结果；图3所示不同避光反应温度对本发明检测方法△f的影响结果；图4所示不同避光反应时间对本发明检测方法△f的影响结果；图5所示不同甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液的ph值对本发明检测方法△f的影响结果；图6所示本发明检测方法的标准曲线；图7所示潜在干扰物质对本发明香菇多糖测定的影响结果；图8所示dmso对本发明香菇多糖测定的影响结果；图9所示现有专利cn107132149a方法的标准曲线；图10所示潜在干扰物之对现有专利cn107132149a方法对香菇多糖测定的影响。具体实施方式本发明公开了一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述检测方法已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述检测方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下就本发明所提供的一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法做进一步说明。实施例1：不同激发波长和发射波长对本发明检测方法△f的影响香菇多糖标准品溶液：取香菇多糖标准品约0.01g，精密称定，溶于0.5mol/lnaoh溶液12.8ml，加入0.2mol/l甘氨酸50ml，用双蒸水定容至100ml，得到100μg/ml香菇多糖标准品溶液，4℃保存；苯胺蓝工作液：取苯胺蓝约0.1g，精密称定，溶于ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，定容至100ml，得到0.1％苯胺蓝工作液。在实验过程中，根据不同波长下的△f变化检测激发波长和发射波长的影响程度。取0.1％苯胺蓝工作液0.4ml和香菇多糖标准品溶液50μl，以ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至1ml，80℃避光反应15min，冷却至室温，进行荧光光谱扫描。结果如表1-2和图1所示，其中f表示实验组荧光强度，即标准品或待测样品溶液反应后荧光强度，f0表示空白对照组荧光强度，即苯胺蓝工作液自身荧光强度；表1表2发射波长(nm)f0f4621.686.134722.318.524822.409.234922.779.895022.939.345122.939.205222.978.835322.858.185422.706.925522.305.535621.884.855721.884.185821.553.395921.552.906021.332.546121.131.936220.931.586320.811.416420.611.206500.611.08根据上述结果可以明显看出，激发波长在390-420nm，发射波长在470-530nm的范围下都能够获得较为明显的荧光强度变化，其中以404nm激发波长和492nm发射波长为最佳。实施例2：不同苯胺蓝工作液浓度对本发明检测方法△f的影响配制浓度分别为0.025％、0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％、3.2％和6.4％的苯胺蓝工作液，分别在容量瓶中加入不同浓度的苯胺蓝工作液0.4ml和香菇多糖标准品溶液(100μg/ml)0.6ml，80℃避光反应15min，冷却至室温，进行荧光光谱扫描，404nm激发波长和492nm发射波长，测定△f；结果见表3和图2。表3根据上述结果可以明显看出，在0.05％-3.2％的范围内都有比较大的△f的变化，这其中以0.1％为最佳。实施例3：不同避光反应温度和时间对本发明检测方法△f的影响1、反应温度分别在容量瓶中加入0.1％苯胺蓝工作液0.4ml和香菇多糖标准品溶液(100μg/ml)40μl，以ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液定容至1ml，分别在20、30、40、50、60、70、80及90℃环境中避光反应15min，冷却至室温，进行荧光光谱扫描，404nm激发波长和492nm发射波长，测定△f；结果见表4和图3。表4在一定温度范围内，△f随温度的升高而增强，在40-90℃范围内有较大的△f变化，在80℃达到最大值，表明较高的温度加速分子运动，有利于苯胺蓝分子更快更完全地进入到香菇多糖三股螺旋结构的空隙中。当温度达到90℃时，△f开始下降，表明过高的温度导致染料分子非辐射跃迁几率增加，△f降低。2、反应时间分别在容量瓶中加入0.1％苯胺蓝工作液0.4ml和香菇多糖标准品溶液(100μg/ml)40μl，以ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液定容至1ml，80℃避光反应2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50min，冷却至室温，进行荧光光谱扫描，404nm激发波长和492nm发射波长，测定△f变化；结果见表5和图4。表5随着加热时间延长，△f逐渐增强，反应15min后，△f达到最大值，且15-50min内体系△f基本无变化，表明15min即可使苯胺蓝分子与三股螺旋结构香菇多糖反应完全，因此选择15min为最佳加热反应时间。实施例4：不同甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液的ph值对本发明检测方法△f的影响分别在容量瓶中加入0.1％苯胺蓝工作液0.4ml和香菇多糖标准品溶液(100μg/ml)40μl，以ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液定容至1ml，再用0.01-1mol/lnaoh和hcl调节ph分别为2、5、7、8、9、10、11、12，80℃避光反应15min，冷却至室温，进行荧光光谱扫描，404nm激发波长和492nm发射波长，测定△f变化；结果见表6和图5。表6ph能够显著影响苯胺蓝与香菇多糖的反应。在酸性条件下，△f很弱；随着体系ph升高，△f逐渐增强，在7-12范围内有比较明显的△f。当ph为10时，△f达到最大，因此选择ph10作为最优反应ph。实施例5：本发明所述检测方法的方法学考察以实施例1-4中最佳参数作为考察方法。1、精密度平行6次测定最终浓度为20μg/ml香菇多糖标准品溶液的△f，计算rsd；结果见表7。表7精密度试验由以上数据可知，精密度试验rsd为0.62％，表明本发明检测方法精密度良好。2、稳定性于0、2、4、6、8、10和12h时测定香菇多糖标准品溶液(100μg/ml)的△f，计算rsd：结果见表8。表8稳定性考察由以上数据可知，稳定性试验rsd为0.37％，表明本发明检测方法对不同时间段的样品稳定性良好。3、加样回收试验量取已知浓度的香菇多糖溶液25μl，加入0.1％苯胺蓝工作液0.4ml，分别加入香菇多糖标准品溶液(100μg/ml)0、25、50、75μl，以ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至1ml，80℃避光反应15min，冷却至室温，测定△f变化，计算平均回收率及rsd。回收率(％)＝(a-b)/c×100％注：a-加入香菇多糖溶液后总香菇多糖测定浓度(μg/ml)；b-香菇多糖溶液的测定浓度(μg/ml)；c-加入香菇多糖标准品的浓度(μg/ml)；结果如表9所示，回收率在99.20％-102.80％之间，平均回收率为100.65％，rsd为1.53％，证明该法测定香菇多糖的准确度高。表9加样回收试验4、线性关系取0.1％苯胺蓝工作液0.4ml，分别加入香菇多糖标准品溶液0-0.6ml，以ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至1ml，80℃避光反应15min，冷却至室温，测定△f。以△f为纵坐标，香菇多糖溶液浓度为横坐标做图，建立标准曲线；结果见表10和图6。表10根据上述结果可知，香菇多糖标准曲线为y＝2.0948x-0.4146，r2＝09998；在0-60μg/ml范围内具有良好的线性关系。5、lod取0.1％苯胺蓝工作液0.4ml，加入香菇多糖标准品溶液(100μg/ml)0-0.1ml，以ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至1ml，80℃避光反应15min，冷却至室温，测定△f变化。根据药典检测限信噪比法，以信噪比为3:1时相应的香菇多糖浓度确定lod；结果见表11表11lod测定香菇多糖浓度(μg/ml)△f信噪比0.00.34251.00000.10.72781.12500.251.05482.07970.51.37743.02161.01.69633.9527结果由上表可知，lod为0.5μg/ml，表明本发明检测方法的灵敏度极高。实施例6：本发明所述检测方法的专属性考察1、潜在干扰物的影响取0.1％苯胺蓝工作液0.4ml和香菇多糖标准品溶液(100μg/ml)40μl，分别加入0、20、40、60、80、100、120、140、160、180和200μl的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、纤维素、党参多糖、黄原胶、木聚糖溶液(1mg/ml)，以ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至1ml，80℃避光反应15min，冷却至室温，测定△f变化；结果如图7所示，体系中香菇多糖终浓度为4μg/ml，添加50倍浓度以内的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维素、淀粉、黄原胶、党参多糖和木聚糖对荧光测定均无影响，说明该方法专属性良好。2、dmso对荧光测定的影响：取香菇多糖标准品约0.0010g，精密称定，溶于dmso，用ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至10ml，dmso终含量分别为0、2、10、50％。分别取0.1％苯胺蓝工作液0.4ml和上述香菇多糖标准品溶液40μl，用ph100.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至1ml，80℃避光反应15min，冷却至室温，测定△f变化；结果如图8所示，荧光苯胺蓝△f随体系中dmso浓度的增加而减小。dmso可破坏香菇多糖分子间氢键，使三螺旋结构被破坏，导致苯胺蓝无法与香菇多糖结合，导致荧光强度降低，进一步说明了苯胺蓝与香菇多糖三螺旋结构结合的特异性。实施例7：不同检测方法之间的对比试验方法：现有专利cn107132149a实施例1-实施例4的相关检测方法，检测对象更改为三螺旋结构的香菇多糖；1、精密度平行6次测定最终浓度为20μg/ml香菇多糖标准品溶液，计算rsd；结果见表12。表12精密度试验2、稳定性于0、2、4、6、8、10和12h时测定香菇多糖标准品溶液(100μg/ml)的含量，计算rsd：结果见表13。表13稳定性考察3、加样回收试验按照实施例5中的方式结合现有专利的方法测其加样回收率，结果见表14。表14加样回收试验4、线性关系根据现有专利实施例1的方法，建立标准曲线；结果见表15和图9。表15浓度(μg/ml)1510△f5.01±0.0125.64±0.1854.17±0.03浓度(μg/ml)152030△f75.29±0.16103.58±0.24156.03±0.12浓度(μg/ml)405060△f206.35±0.27262.38±0.15312.72±0.13根据上述结果可知，香菇多糖标准曲线为y＝5.220x-0.5173；在0～60μg/ml范围内具有良好的线性关系。5、lod根据药典检测限信噪比法，以信噪比为3:1时相应的香菇多糖浓度确定lod；结果见表16表16lod测定香菇多糖浓度(μg/ml)△f信噪比0.000.28641.00000.100.61051.13160.250.76871.68400.500.99472.47311.001.15763.0418结果由上表可知，lod为1.00μg/ml，表明该检测方法的灵敏度高。6、专属性考察根据现有专利实施例30050-0051段的方法，结合实施例6中1中的方法，考察利用现有专利方法检测三螺旋结构的香菇多糖的专属性，结果见图10。结果如图10所示，添加50倍浓度以内的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维素、淀粉、黄原胶、党参多糖和木聚糖对荧光测定均无影响，说明该方法专属性良好。综上所述，本发明与现有发明相比，无论在精密度、稳定性、加样回收试验、线性关系及灵敏度方面，均表现出一定的优势。值得注意的是，在样品前处理方面，现有发明中样品与0.5％苯胺蓝(100μl)需反应20min，而本发明中样品与0.1％苯胺蓝(400μl)反应15min即可。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12