本发明涉及医药技术领域,特别涉及一液相色谱串联质谱法检测血清血浆中抗焦虑/催眠类药物的试剂盒及其应用,所述试剂盒被适用于使用串联质谱法检测血清血浆中抗焦虑/催眠类药物及其代谢物。
背景技术
抗焦虑/催眠类药物是一种有效帮助睡眠和有效改善睡眠的良药,能避免失眠对人体的严重危害,用于治疗失眠病,提高睡眠质量,主要用于焦虑和烦躁等的对症治疗,常用的抗焦虑/催眠类药物有苯巴比妥、眠尔通、利眠宁和安定,然而这些药物是存在一定的副作用的:1.恶心或呕吐;2.全身不适或乏力;3.心动过速或出汗;4.焦虑或激动;5.姿势性血压下降;6.手、舌和眼睑的粗大震颤;7.失眠加重;8.癫痫大发作,并且在长期服用过量的抗焦虑药之后,患者容易对其产生依赖性,所以在患者使用这类药物时需要严格把控用药浓度,药物浓度低了达不到药效,而药物浓度高了又会对机体产生副作用,如何快速筛查抗焦虑药及其代谢物的浓度对于临床诊断和治疗来说非常重要。
实际上,药物的实际医用疗效与用药剂量之间没有直接的关联,而是与个体血清中的药物活性代谢物浓度关联性更大。目前针对抗焦虑药此类的精神药物的筛查有很多方法:气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-二极管阵列检测法和色相色谱-质谱联用法等,然而在这么多检测方法当中液相色谱-三重四极质谱法因其高灵敏度和高选择性已成为精神药物的金标准方法。
镇静药也属于抗焦虑药中的一类,目前市面上在2010年在《色谱》公告的一篇期刊“超高效液相色谱-串联质谱法检测猪肉和猪肾中残留的10种镇静剂药物”,虽然其检测的标的客体是猪肉和猪肾,然而还是不是直接检测人体血清和/血浆中镇静剂药物及其代谢产物。相类似地,虽然还有其他文献也公开了通过液相色谱串联质谱法检测抗焦虑药的方法,然而都不是直接检测人体血清和/血浆中抗焦虑药物及其代谢产物。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供一液相色谱串联质谱法检测血清血浆中抗焦虑/催眠类药物及其药物的试剂盒,所述试剂盒被应用检测人血清或血浆样本中的抗焦虑/催眠类药物及其代谢物,所述试剂盒内含有高效血清血浆药物萃取组合物,所述血清血浆药物萃取组合物高效萃取对应药物和代谢物,提高了试剂盒对检测标的的响应值,从而提高了检测的灵敏度以及特异性。
使用本试剂盒进行抗焦虑/催眠类药物质谱检测时具有如下好处:
1、使用稳定同位素内标法:因稳定同位素内标与分析的物质具有几乎相同的物理化学性质,可以有效减少基质效应,使检测结果更加准确。
2、同时检测药物和活性代谢物:有些药物不仅自身具有药理活性,其代谢物也具有与原药相同的药理作用。将药物的活性代谢物也纳入到监测的范围,可以更好的解释患者血药浓度与治疗效果的相关性。
3、同时检测多种精神类药物,检测时间缩短到2分钟,大大提高了检测通量:普通高效液相法的检测时间通常是10分钟到20分钟不等,而且一次只能检测一种或两种药物,可以同时测定十几种甚至更多药物,而且检测时间只有2分钟,大大提高了检测通量,可以满足临床高通量的样品检测需求。
为了实现上述目的,本发明提供一液相色谱串联质谱法检测血清血浆中抗焦虑/催眠类药物的试剂盒及其应用,所述抗焦虑/催眠类药物试剂盒被应用于使用液相色谱串联质谱法检测抗焦虑/催眠类药物,其中所述抗焦虑/催眠类药物包括以下9种:溴西泮,氯硝西泮,地西泮,劳拉西泮,咪达唑仑,硝西泮,奥沙西泮,替马西泮。
所述液相色谱串联质谱法检测血清血浆中抗焦虑/催眠类药物的试剂盒包括以下试剂:
1、药物标准品:溴西泮,氯硝西泮,地西泮,劳拉西泮,咪达唑仑,硝西泮,奥沙西泮,替马西泮。
2、药物内标化合物:阿普唑仑-d5,氯硝西泮-d4,地西泮-d5,劳拉西泮-d4,咪达唑仑-d4,硝西泮-d5,奥沙西泮-d5,替马西泮-d5。
3、药物萃取组合物:体积占比为60%的甲醇溶液,20%的乙腈溶液,10%的异丙醇溶液以及10%的纯化水。
4、阴性血浆。
5、稀释剂:50%甲醇水溶液
利用所述试剂盒配置药物标准溶液:利用药物萃取组合物溶解药物标准品,并稀释制成1mg/ml的药物标准溶液,值得注意的是,此时指的所述药物标准溶液中包含其上提到的11种抗精神药物标准品,从而便于后续液相色谱串联检测时可同时检测多种抗精神药物标准品。
所述药物标准溶液被50%甲醇水溶液稀释得到的浓度分别为1.0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml。
所述药物内标化合物利用所述药物萃取组合物溶解,得到100μg/ml的内标溶液,用50%甲醇水溶液稀释后得到25ng/ml的内标工作液,相同地,所述内标工作液内也包括11种抗精神药物内标化合物。
往阴性血浆中加入低、高浓度的药物标准溶液,得到高低质控溶液的浓度为2.5ng/ml、400ng/ml,分别记录为qcl、qch。
另外,所述试剂盒中被应用于制备各种溶液的制备方法如下,值得一提的是,以下仅提供一具体的制备数据,但其制备数据不作为限制:
1、药物标准溶液的制备:
各取10mg的药物标准品,置于10ml量瓶中,用药物萃取组合物溶解,定容并稀释,得到1.0mg/ml的药物标准溶液。
用50%甲醇水溶液溶解并定容、稀释,制成不同浓度的标准溶液,得到浓度分别为1.0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的标准溶液。
2、药物内标溶液的制备:
取用药物内标化合物,使用药物萃取组合物溶解所述药物内标化合物,并转移至10ml量瓶,得到浓度为100μg/ml的内标溶液,稀释后得到浓度为25ng/ml的内标工作液。
3、质控品溶液的制备:
精密吸取阴性血浆90μl,分别加入低、高浓度标准溶液10μl,使其得到最终标准品的终浓度分别为2.5ng/ml、400ng/ml,标记为qcl、qch。
所述试剂盒也被应用于检测人血清/血浆中的抗焦虑/催眠类药物,通过使用液相色谱串联质谱法进行检测,使用方法如下:
1.制备药物标准溶液,药物内标工作液,高低质控品;
2.混合设定比例的药物标准溶液和药物内标工作液,利用液相色谱串联质谱法进行检测,以标准溶液中各化合物的峰面积与内标化合物的峰面积的比值为纵坐标,以标准溶液中各化合物相应的浓度为横坐标进行线性回归,获得各化合物线性回归方程;
3.混合设定比例的药物内标工作液至检测药品中,利用液相色谱串联质谱法进行检测,将实际样品中各化合物的峰面积与内标化合物的峰面积的比值带入标准曲线线性方程计算实际样本的浓度。
综上所述,本发明提供一液相色谱串联质谱法检测血清血浆中抗焦虑/催眠类药物的试剂盒,所述试剂盒被应用于结合液相色谱串联质谱法检测人血清/血浆中的抗焦虑/催眠类药物,并且所述试剂盒的设置中内标物的选择极大程度地减少了基质效应,并且可同时检测药物及其活动代谢物。
附图说明
图1到图2是根据本发明的实施例的液相色谱串联质谱法检测抗焦虑/催眠类药物的试剂盒检测待测样本时得到的质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
可以理解的是,术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”,即在一个实施例中,一个元件的数量可以为一个,而在另外的实施例中,该元件的数量可以为多个,术语“一”不能理解为对数量的限制。
本发明提供的液相色谱串联质谱法检测血清血浆中抗焦虑/催眠类药物的试剂盒的试剂组合如下所示:
所述试剂盒被应用于通过液相色谱串联质谱检测血浆/血清中抗焦虑/催眠类药物,以下将以一具体的实施例说明其检测过程:
实施例1:
1.材料:
1.1仪器与试剂:
仪器:10ml量瓶、定容瓶、涡旋仪,离心机,液相色谱系统,三重四级杆质谱仪。
试剂:试剂盒,检测血清和/或检测血浆。
2.试剂准备步骤:
2.1药物标准溶液的制备:
各取10mg的药物标准品,置于10ml量瓶中,用药物萃取组合物溶解,定容并稀释,得到1.0mg/ml的药物标准溶液。
用50%甲醇水溶液溶解并定容、稀释,制成不同浓度的标准溶液,得到浓度分别为1.0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的标准溶液。
2.2药物内标溶液的制备:
取用的药物内标化合物,使用药物萃取组合物溶解所述药物内标化合物,并转移至10ml量瓶,得到浓度为100μg/ml的内标溶液,稀释后得到浓度为25ng/ml的内标工作液。
2.3质控品溶液的制备:
精密吸取阴性血浆90μl,分别加入低、高浓度标准溶液10μl,使其得到最终标准品的终浓度分别为2.5ng/ml、400ng/ml,标记为qcl、qch。
3、检测样品准备:
标准检测样品的制备:
取不同浓度的药物标准溶液100μl,加入400μl内标工作液,涡旋混合3min,于4℃11000rpm离心15min,取上清液300μl于4℃11000rpm离心15min准备进样分析。
实验检测样品的制备:
精密吸取血清样品100μl,加入400μl内标工作液,涡旋混合3min,于4℃11000rpm离心15min,取上清液300μl于4℃11000rpm离心15min准备进样分析。
质控检测样品的制备:
取qcl和qch溶液10μl,加入400μl内标工作液,涡旋混合3min,于4℃11000rpm离心15min,取上清液300μl于4℃11000rpm离心15min进样分析。
4.检测:
取相同分量的标准检测样品、实验检测样品以及质控检测样品分别利用液相色谱串联质谱法进行检测,并且其条件设置为一致,以得到以标准检测样品中各化合物的峰面积与内标化合物的峰面积的比值为纵坐标,以标准检测样品中各化合物相应的浓度为横坐标进行线性回归,获得各化合物线性回归方程。将实验检测样品中各化合物的峰面积与内标化合物的峰面积的比值带入标准曲线线性方程计算实验检测样品的浓度。
检测的条件设置如下:
离子源为电喷雾电离离子源(esi,正离子模式);毛细管电压3.0kv;去溶剂气温度500℃;去溶剂气流速800l·h-1;锥孔反吹气流速50l·h-1;源温度150℃;去溶剂气和锥孔反吹气为氮气(纯度99.9%);碰撞气为氩气(纯度99.999%);扫描方式为多重反应离子监测(mrm),优化后的离子检测参数:母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量详细数值见表一:
表一:各抗焦虑/催眠类药物和内标的质谱参数
2.结果与讨论:
表二:各抗焦虑/催眠类药物的线性范围
如表二所示,快速有效地得到9种抗焦虑药物的线性方程,如图1到图2所示,可得到检测样品的检测图谱,并且从所述检测图谱中可以看到其检测效果更加准确,并且其9种物质同时检测的效率高,检测时间缩短到2分钟,大大提高了检测通量。图中:asxp-奥沙西泮、dxp-地西泮、xiaoxp-硝西泮、llxp-劳拉西泮、xiuxp-溴西泮、timxp-替马西泮。
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。