基于金纳米团簇探针的人附睾蛋白4检测方法及其试剂盒与流程

本发明涉及一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法及其检测试剂盒，属于分析化学及纳米技术领域。

背景技术：

恶性肿瘤是影响人民生命健康的一类重要疾病，成为全球最大的公共卫生问题。在女性生殖系统中，卵巢癌在妇科恶性肿瘤中的发病率排名第三，死亡率排在第一位。近70％的卵巢癌患者被诊断为晚期，卵巢癌患者的5年生存率通过早期有效治疗上升至90％。因此，早期诊断对于改善卵巢癌的预后至关重要。目前，最常用于卵巢癌早期诊断的血清生物标志物是ca125。但对于盆腔炎患者，如子宫内膜异位症、结核性腹膜炎，血清中的ca125也可能升高。因此，ca125在卵巢癌诊断中的应用表现出较高的假阳性率，有时会导致不必要的手术。人附睾蛋白4（humanepididymisprotein4，he4）被认为是卵巢癌早期诊断的新生物标志物。据报道，he4对早期卵巢癌高度敏感，可与ca125联合使用，为卵巢癌及其他盆腔肿块的鉴别诊断提供最佳方法。目前用于检测血清中人附睾蛋白4含量的免疫分析方法已发展出很多种，如酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法、电致化学发光免疫分析和荧光免疫分析法等。酶联免疫分析法在过去三十年内一直被认为是最成熟的方法和黄金标准,但酶联免疫分析法仍然有一定的缺陷，如灵敏低，无法检测到血清中极微量的生物标志物。化学发光免疫分析法也有一些缺点,包括体型较大的分析仪器,高成本和特殊标记要求等。这些因素限制着这些技术的临床应用。电致化学发光免疫分析是近几年发展迅速的一种新型免疫检测方法，该技术具有多样化，更好的灵敏度和选择性，背景信号低，光学装置简单，时间/空间控制性好，线性范围宽等性能特点，己在临床分析及医药、免疫等领域广泛应用，如慢性阻塞性肺病和哮喘的诊断。

寻找新型发光体，发展性能优良的电致化学发光体系是电致化学发光分析的重要研究方向。2002年首次报道了硅纳米粒子的ecl现象，随后涌现了大量纳米材料作为新的ecl发光体，尤其是量子点（cds、zns、cdte）已被广泛应用于ecl体系。金纳米团簇由几十到几百个金原子组成，具有的生物相容性好、量子尺寸效应、特殊光电性质等特性，在催化、传感和光电子学等领域被广泛应用。但是由于其电致化学发光强度小、量子产率低、发光机制不清楚等问题的限制，金纳米团簇在电致化学发光领域的研究还非常少。针对上述问题，本课题组通过控制金簇价态的方法制备得到了高量子产率的金纳米团簇探针，并将其应用于细胞释放多巴胺的检测及小分子生物硫醇等生物分子的高灵敏、快速检测。面对临床肿瘤诊疗的迫切需求，设计和开发了一种新型高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针的免疫传感器并将其用于肿瘤标志物的检测具有较重要的学术创新性和临床应用价值。

本发明提供了一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法，及基于该方法制备的检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法。

本发明的另一个目的在于提供一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人附睾蛋白4抗体，加入人附睾蛋白4，再加入生物素标记的人附睾蛋白4抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人附睾蛋白4的检测。

所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：

（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入0.1mol/l、ph7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4v~-2v范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针；

（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/l硼氢化钠溶液反应5min~30min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。

所述电极表面修饰二氧化锰纳米材料采用下述的电化学沉积法或滴涂法制备：

（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用i-t法，在1:1v/v的kmno4-h2so4溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1v~-0.5v，沉积时间为100s~600s，清洗，氮气吹干；

（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500μl、10mmol/l的kmno4溶液加入到1.25ml、0.1mol/l、ph6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5ml后超声30min，结束后12000r.p.m离心10min，用水洗3次，重新分散于2.5ml去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液；取5μl滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。

所述在空白酶标板固定人附睾蛋白4抗体的方法为自组装法：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5mg/mlph8.5的多巴胺溶液50~100μl，于4℃反应1~5h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5mg/ml人附睾蛋白4抗体溶液，4℃孵育8~12h，漂洗；加入50~100μl1wt%~5wt%的牛血清白蛋白溶液，于4℃反应0.5~2h，洗涤，拍干。

所述加入人附睾蛋白4，再加入生物素标记的人附睾蛋白4抗体，形成夹心免疫复合物的方法为：在固定有人附睾蛋白4抗体酶标板的样品反应孔中加入人附睾蛋白4样本，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育30min~60min，洗涤，拍干；加入0.1~10μg/ml生物素标记的人附睾蛋白4抗体50μl，37℃温育30min~60min，洗涤，拍干。

所述加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐的方法为：在形成夹心免疫复合物的酶标板孔中每孔分别加入50μl的0.1~1u/ml链霉亲和素-碱性磷酸酶和5~10mmol/l2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液，轻轻振荡混匀，避光反应，37℃温育30min~60min。

所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲溶液，所用电解质为kcl或kno3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，施加一定的扫描电压，工作电极表面产生电致化学发光辐射，光电倍增管高压设置为600~800v，检测电致化学发光辐射信号。

所述根据电致化学发光信号的改变实现人附睾蛋白4的检测为：电极表面所采集的电致化学发光信号的电致化学发光强度值与人附睾蛋白4浓度的对数值在0.01pmol/l~6pmol/l的范围内呈线性关系，检测限为0.004pmol/l。

本发明所述的基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法的检测试剂盒，其特征在于，包括金纳米团簇溶液、二氧化锰纳米材料、人附睾蛋白4抗体固定酶标板、人附睾蛋白4标准品、生物素标记的人附睾蛋白4抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶、2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐、洗涤液、电致化学发光测试电解质溶液。

所述的人附睾蛋白4抗体固定酶标板为：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5mg/mlph8.5的多巴胺溶液50~100μl，于4℃反应1~5h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5mg/ml人附睾蛋白4抗体溶液，4℃孵育8~12h，漂洗；加入50~100μl1wt%~5wt%的牛血清白蛋白溶液，于4℃反应0.5~2h，洗涤，拍干；所述洗涤液为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲溶液；所述的电致化学发光测试电解质溶液为含有过硫酸钾的缓冲溶液。

具体地说，为了实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：首先制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，以二氧化锰为电致化学发光猝灭剂，进而利用酶联免疫反应，在夹心免疫反应的基础上，基于链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液和2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐反应产生的抗坏血酸与二氧化锰的氧化学原反应恢复电致化学发光信号，由此发展一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光免疫分析方法，用于肿瘤标志物人附睾蛋白4的高效检测。本发明包括以下步骤：

（一）高量子产率金纳米团簇探针制备

高量子产率金纳米团簇探针制备方法如下：

（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入缓冲溶液中，施加负电位电压（-1.4v~-2v范围内），进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针。

（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/l硼氢化钠溶液反应5~30min（优选0.1mol/l硼氢化钠溶液反应5min），得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。

所述的金纳米团簇材料为功能化修饰金纳米团簇，如：n-乙酰化-l-半胱氨酸-金纳米团簇，牛血清白蛋白-金纳米团簇等。

（二）电致化学发光信号采集方法

将电极抛光，再依次放入hno3溶液、无水乙醇和去离子水中超声清洗，n2吹干。采用三电极体系进行测试，以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为600v~800v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。

所述电极为玻碳电极、丝网印刷电极或ito电极等。上述共反应剂为过硫酸根离子，浓度范围为0.01~1mol/l，优选0.1mol/l。所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲溶液，在缓冲溶液中所添加电解质为kcl或kno3，浓度为0.01~1mol/l，优选0.1mol/l。

（三）二氧化锰纳米材料修饰方法

（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用i-t法，在kmno4-h2so4（1:1v/v）溶液中，电化学沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1v~-0.5v，沉积时间为100s~600s，优选-0.2v，300s，之后用双蒸水冲洗干净，氮气吹干备用。

（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500μl10mmol/l的kmno4溶液加入到1.25ml0.1mol/lph6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5ml后超声30min，结束后12000r.p.m离心10min，用水洗3次，重新分散于2.5ml去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液。取5μl滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。

（四）夹心免疫反应体系构建

夹心免疫反应体系构建具体步骤如下：（1）将空白酶标板设空白孔（空白对照孔不加样品，其余各步骤操作相同）、标准品孔、待测样品孔。取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入50μl1~5mg/ml的多巴胺溶液（ph8.5的tris-hcl缓冲溶液溶解），于4℃反应1~5h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干。再滴加0.1~0.5mg/ml人附睾蛋白4抗体溶液，4℃孵育8~12h，漂洗。加入50~200μl1%~5%的牛血清白蛋白溶液，于4℃反应0.5~2h，反应完成后洗涤（小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干）。然后在标准品孔中加入人附睾蛋白4标准溶液50μl，在样品反应孔中加入50μl样本，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育30~60min，洗涤，拍干，再加入0.1~10μg/ml生物素标记的人附睾蛋白4抗体50μl，37℃温育30~60min，洗涤，拍干。每孔加入0.1~1u/ml链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液50μl，轻轻振荡混匀，37℃温育30~60min，用10mmph=7.3tris-hcl缓冲液洗涤，拍干。

（五）人附睾蛋白4的测定

人附睾蛋白4检测步骤如下：往上述构建的所述的夹心免疫反应体系的酶标板中加入5~10mmol/l2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液50μl，再加入10mmph=8.0tris-hcl缓冲溶液50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光反应25~30min。将上述二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述反应液中浸泡4~10min，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。采集工作电极表面产生的电致化学发光信号，以电致化学发光信号对人附睾蛋白4浓度作图绘制标准曲线。

（六）试剂盒

一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测试剂盒，其中包括金纳米团簇溶液、二氧化锰纳米材料、人附睾蛋白4抗体固定酶标板、人附睾蛋白4标准品、生物素标记的人附睾蛋白4抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶、2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐、洗涤液、电致化学发光测试电解质溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明以高量子产率金纳米团簇探针为电致化学发光材料，以纳米二氧化锰为电致化学发光猝灭剂，利用酶联免疫反应产生抗坏血酸恢复其电致化学发光信号实现人附睾蛋白4的检测。本发明对人附睾蛋白4的检测灵敏度高、操作简单，可有效避免检测过程中实际样品复杂成份的干扰，因而特异性好、准确度高。并且，本发明成本低、制作简单、稳定性好、灵敏度好，线性范围宽（0.01pmol/l~6pmol/l），检测限低（0.004pmol/l），具有很好的市场价值。

附图说明

图1为金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。

图2为二氧化锰/金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。

图3为本发明检测人附睾蛋白4的电致化学发光-时间曲线图（人附睾蛋白4浓度为6pmol/l）。

图4为电致化学发光强度变化与人附睾蛋白4浓度对数值之间的线性关系图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。

本发明所用的人附睾蛋白4抗体（武汉默沙克生物科技有限公司），人附睾蛋白4（武汉默沙克生物科技有限公司），生物素标记的人附睾蛋白4抗体（武汉默沙克生物科技有限公司），链霉亲和素-碱性磷酸酶（武汉博士德生物工程有限公司），2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐（sigma-aldrich公司）为现有技术产品。

实施例1

取0.6ml0.5mol/l的naoh与0.4ml20mg/ml氯金酸溶液加入到4ml0.08mol/l的n-乙酰-l-半胱氨酸溶液中，混匀后置于37℃恒温水槽中孵育3小时。待反应结束后，用分子量为3000的透析袋对反应液透析纯化24h，得到纯化后的n-乙酰-l-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液，于4℃冰箱避光保存。

实施例2

将直径3mm的玻碳电极用1.0μm、0.3μm，0.05μm的al2o3粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入hno3溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，n2吹干。取5μl实施例1制得的n-乙酰-l-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，并进一步将该电极浸泡在0.1mol/l硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰电极。将上述电极插入含有0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图1）。

实施例3

将直径3mm的玻碳电极用1.0μm、0.3μm，0.05μm的al2o3粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入hno3溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，n2吹干。取5μl实施例1制得的n-乙酰-l-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，并进一步将该电极浸泡在0.1mol/l硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰玻碳电极。采用三电极体系，以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用计时电流法，在kmno4-h2so4（1:1v/v）溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.2v，时间为300s，所得到的电极为二氧化锰/金纳米团簇修饰玻碳电极，之后用双蒸水冲洗干净，n2气轻轻吹干备用。将上述电极插入含有0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图2）。

实施例4

取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入50μl5mg/ml的多巴胺溶液（ph8.5的tris-hcl缓冲溶液溶解），于4℃反应2h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干。再滴加100μg/ml人附睾蛋白4抗体溶液，4℃孵育12h。孵育结束后用水轻轻漂洗，以便除去电极表面非特异性吸附的抗体。接着加入1%的牛血清白蛋白溶液50μl，于4℃反应1h，反应完成后洗涤（小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干），得到人附睾蛋白4抗体固定酶标板。

实施例5

在实施例4制得的人附睾蛋白4抗体固定酶标板的标准品孔中加入6pmol/l的人附睾蛋白4标准溶液50μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育30min，洗涤，拍干，再加入0.5μg/ml生物素标记的人附睾蛋白4抗体50μl，37℃温育30min，洗涤，拍干。每孔加入0.2u/ml链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液50μl（37℃预热30min），轻轻振荡混匀，37℃温育45min，洗涤，拍干。再往上述酶标板中加入8mmol/l的2-酸磷-l-抗坏血酸三钠盐溶液50μl（37℃预热30min），再加入ph=8.0tri-hcl50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光反应25min。将各个孔中的液体取出，加入2ml的ep管当中，将处理好的电极放入各个对应浓度ep管中浸泡10min，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。将上述电极插入含有0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到的电化学发光信号比未加人附睾蛋白4的溶液明显增大（图3）。

实施例6

取空白酶标板，将空白酶标板设空白孔（空白对照孔不加样品，其余各步骤操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在空白酶标板各孔中加入50μl5mg/ml的多巴胺溶液（ph8.5的tris-hcl缓冲溶液溶解），于4℃反应2h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干。再滴加200μg/ml人附睾蛋白4抗体溶液，4℃孵育12h。孵育结束后用水轻轻漂洗，以便除去电极表面非特异性吸附的抗体。接着加入1%的牛血清白蛋白溶液50μl，于4℃反应1h，反应完成后洗涤（小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干）。然后在标准品孔中加入不同浓度的人附睾蛋白4标准溶液50μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育30min，洗涤，拍干，再加入0.5μg/ml生物素标记的人附睾蛋白4抗体50μl，37℃温育30min，洗涤，拍干。每孔加入0.2u/ml链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液50μl（37℃预热30min），轻轻振荡混匀，37℃温育45min，洗涤，拍干。再往上述酶标板中加入8mmol/l的2-酸磷-l-抗坏血酸三钠盐溶液50μl（37℃预热30min），再加入ph=8.0tri-hcl50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光反应25min。将各个孔中的液体取出，加入2ml的ep管当中，将处理好的电极放入各个对应浓度ep管中浸泡10min。取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。将上述电极插入含有0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，在人附睾蛋白4浓度为0.01pmol/l~6pmol/l的范围内人附睾蛋白4浓度的对数值与电致化学发光强度值呈良好的线性关系，检测限为0.004pmol/l（见图4）。

实施例7

取500μl10mmol/l的kmno4溶液加入到1.25ml0.1mol/lph6.0的2-（n-吗啉代）乙磺酸（mes）缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5ml后超声30min，结束后12000r.p.m离心10min，用水洗3次，重新分散于2.5ml去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液。

实施例8

试剂盒使用方法：（1）取5μl实施例1制备的n-乙酰-l-半胱氨酸保护的金纳米团簇滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥。并进一步将该电极浸泡在0.1mol/l硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰玻碳电极。取6μl实施例7制备的mno2纳米片溶液滴加在上述金纳米团簇探针修饰玻碳电极表面，室温干燥，得到二氧化锰/金纳米团簇修饰玻碳电极。（2）取实施例4制备的人附睾蛋白4抗体固定酶标板，将其设为空白孔（空白对照孔不加样品，其余各步骤操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在空白酶标板各孔中加入50μl5mg/ml的多巴胺溶液（ph8.5的tris-hcl缓冲溶液溶解），于4℃反应2h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干。再滴加200μg/ml人附睾蛋白4抗体溶液，4℃孵育12h。孵育结束后用水轻轻漂洗，以便除去电极表面非特异性吸附的抗体。接着加入50μl1%的bsa溶液，于4℃反应1h，反应完成后洗涤（小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干）。然后在标准品孔中加入不同浓度的人附睾蛋白4标准溶液50μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育30min，洗涤，拍干，再加入0.5μg/ml生物素标记的人附睾蛋白4抗体50μl，37℃温育30min，洗涤，拍干。每孔加入0.2u/ml的链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液50μl（37℃预热30min），轻轻振荡混匀，37℃温育45min，洗涤，拍干。再往上述酶标板中加入8mmol/l的2-酸磷-l-抗坏血酸三钠盐溶液50μl（37℃预热30min），再加入ph=8.0tri-hcl50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光反应25min。（3）将各个孔中的液体取出，加入2ml的ep管当中，将处理好的电极放入各个对应浓度ep管中浸泡10min。取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。将上述电极插入含有0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，在人附睾蛋白4浓度为0.01pmol/l~6pmol/l的范围内人附睾蛋白4浓度的对数值与电致化学发光强度变化值呈良好的线性关系，检测限为0.004pmol/l。

以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。