场流分级装置的制作方法

本发明涉及用于利用场流分级(field-flow)来分离/分级流体中所含的微粒的场流分级装置。

背景技术：

作为用于对分散在溶液中的1nm～50μm左右的宽范围的粒径的微粒进行分离并检测或分级的方法，一直以来，已知所谓交叉流方式的场流分级(例如，参照专利文献1。)。

采用了不对称通道结构的交叉流方式的场流分级装置具有用于分离样品的分离通道。形成分离通道的壁面之一成为rc(再生纤维素)、pes(聚醚砜)等具有孔隙的半透膜，进而在该半透膜的外侧设置有被称为玻璃料的多孔平板。被导入到通道内的载送流体透过该壁面，从而产生与从分离通道的入口端口向出口端口流动的前进方向的流(通道流)垂直的方向的流(交叉流)。以下，将在分离通道中设有玻璃料的壁面侧定义为下侧。

分离通道中根据需要形成与通道流对向的流(聚焦流)。从形成分离通道的壁面的半透膜透过的载送流体从与分离通道的出口端口不同的出口端口(排出端口)排出。从玻璃料排出的排出量利用设置于排出端口侧的mfc(质量流量控制器)来控制。

样品从入口端口借由进样器被导入到分离通道内。此时，在分离通道内，形成了由从入口端口供给的载送流体形成的通道流和由从与入口端口不同的出口端口侧的端口供给的载送流体形成的逆流(聚焦流)，被导入到分离通道内的样品被收集在通道流与聚焦流的边界部分。将此称为聚焦。

通过聚焦而被收集在逆流的边界部分的样品颗粒因流体力学半径的差异而产生扩散系数的差异，因此越容易扩散的颗粒，越被收集到分离通道的上侧。将其称为松弛(relaxation)。然后，停止聚焦流，分离通道内的流仅为通道流和交叉流时，利用斯托克斯流，从小的样品颗粒起依次经由出口端口从分离通道排出。在分离通道的出口端口连接有紫外线吸光度检测器等检测器，通过例如从在紫外线区域(190nm～280nm)的吸光度小的样品颗粒起依次被检测器测定，得到场流分级谱图(fractogram)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2008-000724号公报

技术实现要素：

发明要解决的问题

如上所述，现有的场流分级装置利用颗粒的扩散系数的差异来分离样品。但是，例如，想要分离碱性的蛋白质(例如，溶菌酶)与酸性的蛋白质(例如，牛血清白蛋白(bsa))时等，仅依靠颗粒的扩散系数的差异有时无法顺利地分离。

于是，本发明的目的在于提供比仅利用颗粒的扩散系数的差异来进行分离的以往的场流分级装置提高了分离性能的场流分级装置。

用于解决问题的方案

本发明的场流分级装置至少具备：分离通道，其在两端设置有入口端口和出口端口，在前述入口端口与前述出口端口之间形成用于载送流体流动的空间；分离膜，其形成壁面，所述壁面划分出前述分离通道、并且与载送流体在前述分离通道内从前述入口端口向前述出口端口流动的通道流平行，所述分离膜具有使前述载送流体透过且不使分离对象的颗粒透过的性质；以及，排出端口，其将透过了前述分离膜的载送流体向外部排出。此外，前述分离膜的表面的至少一部分形成为修饰有具有离子交换性的官能团的离子交换性区域。

在前述分离膜的表面，具有互不相同的离子交换性的多个前述离子交换性区域可以在沿着前述通道流的方向上并排地配置。通过这样做，能够变更在分离通道内与样品颗粒之间发生的相互作用，能够实现与样品相应的各种各样的分离。

发明的效果

本发明的场流分级装置中，形成与通道流平行的分离通道的壁面的分离膜的表面的至少一部分成为修饰有具有离子交换性的官能团的离子交换性区域，因此能够不仅利用颗粒的扩散系数的差异、还利用颗粒与分离膜之间的离子相互作用来使颗粒分离。由此，碱性蛋白质与酸性蛋白质等迄今难以完全分离的颗粒也能够分离，分离性能提高。

附图说明

图1为示意性示出场流分级装置的一个实施例的立体图。

图2为分别示出(a)通过以往的场流分级装置得到的场流分级谱图和(b)通过该实施例的场流分级装置得到的场流分级谱图的一例的图。

图3为示意性示出场流分级装置的另一实施例的立体图。

附图标记说明

2分离通道

4入口端口

6出口端口

8中间端口

10、10a分离膜

12进样器

14、16送液泵

18载送流体用的容器

20检测器

22废液室

24排出端口

26质量流量控制器

28上游侧区域(离子交换性区域)

30下游侧区域(离子交换性区域)

具体实施方式

以下，对于场流分级装置的一实施例，使用附图进行说明。

首先，使用图1，对该实施例的场流分级装置的构成进行说明。

该实施例的场流分级装置具备：用于使样品颗粒分离的分离通道2，在该分离通道2连通有入口端口4、出口端口6、及中间端口8。入口端口4连通于分离通道2的一端，出口端口6连通于分离通道2的另一端。中间端口8位于入口端口4与出口端口6之间。虽然省略图示，但分离通道2例如形成在层叠多个基板而构成的块(block)的内部，各端口4、6和8由设置在该块上的孔构成。

分离通道2具有大致菱形的形状。分离通道2的一端部与另一端部形成为角部，其平面形状中的宽度尺寸从一端侧起随着向另一端侧前进而暂时变宽，从中途起随着向另一端前进而宽度变窄，在另一端部收敛。

在入口端口4经由进样器12连接有送液泵14，所述送液泵14用于输送在容器18内存储的载送流体。作为分离对象的样品颗粒通过进样器12而被注入，与利用送液泵14输送的载送流体一起从入口端口4被导入到分离通道2内。出口端口6连接于检测器20。

将在分离通道2内从入口端口4向出口端口6行进的流体的流称为“通道流”。与该通道流平行的分离通道2的一个壁面(在图中为下侧的壁面)由具有使载送流体透过且不使样品颗粒透过的性质的分离膜10构成。被导入到分离通道2中的载送流体的一部分透过分离膜10，因此在分离通道2内产生在图中用箭头示出的方向、即与通道流正交的方向的流。将该流称为“交叉流”。需要说明的是，关于分离膜10的详情，在后文进行说明。

透过了分离膜10的载送流体流经在分离通道2的下方设置的废液室22，通过废液端口24而被排出到外部。在与废液端口24连接的流路上设有质量流量控制器(mfc)26，从废液室22排出的载送流体的流量利用mfc26进行检测。

在中间端口8连接有送液泵16，所述送液泵16用于从容器18输送载送流体。送液泵16与用于向入口端口4供给载送流体的送液泵14互相独立地设置，根据需要从中间端口8向分离通道2内供给载送流体。当从入口端口4和中间端口8同时向分离通道2内供给载送流体时，在分离通道2内产生由载送流体形成的对向的流。将该流称为“聚焦流”。

需要说明的是，该实施例中，在入口端口4与中间端口8分别连接有互相独立的送液泵14、16，但也可以如下构成：在这些端口借由旋转阀等切换机构连接共通的送液泵，通过该切换机构而使送液泵在仅连接于入口端口4的状态与连接于样品端口4和中间端口8这两者的状态之间进行切换。

另外，不一定必须设有中间端口8，也可以如下构成：要在分离通道2内形成聚焦流时，根据需要从出口端口6供给载送流体。

此处，对于分离膜10进行说明。

分离膜10例如是在再生纤维素(rc)、聚醚砜(pes)等具有多个孔隙的半透膜的表面修饰具有阳离子交换性或阴离子交换性的官能团而得到的。即，分离膜10的表面整体成为修饰有具有离子交换性的官能团的离子交换性区域。

作为具有阴离子交换性的分离膜10，例如可列举出用阳离子化试剂修饰rc膜的表面而成的膜。作为阳离子化试剂，例如可列举出以缩水甘油基三甲基氯化铵(2,3-环氧丙基三甲基氯化铵)作为主成分的sy-gta80(坂本药品工业株式会社的产品)。此外，作为具有阴离子交换性的分离膜10，可列举出deae(二乙基氨基乙基)纤维素等。

通过使用上述那样的具有阴离子交换性的分离膜10，通过分离膜10与样品颗粒之间的离子相互作用，原本会被分离膜10强力保持的碱性蛋白质的保留时间变短，分离性能提高。

另外，作为具有阳离子交换性的分离膜10，例如可列举出使表面磺化而成的pes膜。此外，作为具有阳离子交换性的分离膜10，可列举出在表面使羧甲基交联而得到的rc膜等。

通过使用上述那样的具有阳离子交换性的分离膜10，通过分离膜10与样品颗粒之间的离子相互作用，原本几乎不会被分离膜10保持的碱性蛋白质的保留时间变长，分离性能提高。

对于基于该实施例的场流分级装置的样品的分离操作进行说明。

样品颗粒与载送流体一起经由入口端口4被导入到分离通道2内。此时，在分离通道2内也从中间端口8供给载送流体，从而生成了聚焦流(逆流)。利用该聚焦流，从入口端口4导入的样品颗粒被收集(聚焦)在来自入口端口4的载送流体的流与来自中间端口8的载送流体的流的边界部分。在分离通道内，还产生了由透过分离膜10的载送流体的流形成的交叉流，在来自入口端口4的载送流体的流与来自中间端口8的载送流体的流的边界部分进行样品颗粒的松弛。

聚焦和松弛完成后，停止送液泵16，聚焦流消失。在分离通道2内，产生了由从入口端口4向出口端口6流动的载送流体形成的通道流、以及由透过分离膜10的载送流体形成的交叉流。

该实施例中，聚焦和松弛完成后的送液泵14的操作速度控制为恒定，利用mfc26控制从排出端口24排出的载送流体的流量、即交叉流的流量。由此，从出口端口6流出的载送流体的流量成为恒定。需要说明的是，也可以如下构成：在始于排出端口24的流路上设置流量计来代替mfc26，基于该流量计的检测流量，以从出口端口6流出的载送流体的流量成为恒定的方式控制送液泵16的操作。

通过聚焦和松弛而被收集在规定位置的样品颗粒一边受到由与分离膜10之间的离子相互作用造成的影响和由交叉流造成的影响，一边向出口端口6侧流动，从这些影响少的颗粒起依次被导入到检测器20，进行检测。

图2为基于场流分级装置的以bsa与溶菌酶的混合试样作为样品的场流分级谱图，(a)为比较例、(b)为实施例。在(a)的比较例中，使用不具有离子交换性的rc膜来代替分离膜10，在(b)的实施例中，作为分离膜10，使用阳离子交换膜(spes：磺化聚醚砜膜)。

如图2的(a)所示，使用不具有离子交换性的rc膜的情况下，bsa与溶菌酶的保留时间接近，难以将这些蛋白质完全分离。与此相对，如图2的(b)所示，通过使用阳离子交换膜作为分离膜10，属于酸性的蛋白质的bsa的保留时间变短，属于碱性的蛋白质的溶菌酶的保留时间变长，结果能够将这些蛋白质完全分离。

因此可知，通过使分离膜10具有离子交换性，即使是仅依靠扩散系数的差异无法充分分离的颗粒，也能够利用离子相互作用来进行分离，场流分级装置的分离性能提高。

需要说明的是，以上说明的实施例中，分离膜10的表面整体成为被同一离子交换性官能团进行了修饰的离子交换性区域，但本发明不限定于此。也可以是分离膜10的表面的仅一部分成为离子交换性区域。另外，也可以如图3所示地将分离膜10a的表面分割为上游侧区域28和下游侧区域30，在这些区域28、30修饰具有互不相同的离子交换性的官能团。由此，在分离膜10a的表面，可在沿着载送流体的流动方向的方向上设置具有互不相同的离子交换性的多个离子交换性区域28、30。