基于SERS检测鸡蛋中四环素类抗生素残留的方法与流程

本发明涉及食品检测技术领域，特别是涉及一种基于sers检测鸡蛋中四环素类抗生素残留的方法。

背景技术：

我国是家禽养殖大国，2005年禽蛋年总产量已达28795万吨，位居世界首位，其中鸡蛋由于营养丰富、易被吸收、口感良好、价格便宜而深受消费者喜爱。鸡蛋占绝大部分禽蛋市场，而90％以上的鸡蛋都是由农户和小企业生产的，尽管目前无公害食品蛋鸡饲养允许使用的治疗药物受到严格限制，但实际生产中，为降低疫病风险，滥用误用抗生素现象十分严重，同时通过环境和食物链的作用致使药物残留问题也日益加剧。

四环素、土霉素、金霉素以及多西环素均为四环素类兽医专用药，在各类动物疾病的预防和治疗中具有良好的应用价值。农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定产蛋鸡不得添加。四环素类抗生素对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有较好的防治作用，该类药物与喹诺酮类药物均属于目前应用最为广泛的兽用抗生素。四环素类药物可在动物体内残留，并随食品进入人体，危害人体健康，尤其是对儿童的牙齿损害最大。

目前，测定该类抗生素药物残留的主要方法有微生物法、酶联检测免疫技术、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱检测技术等。然而，微生物法和酶联检测免疫技术操作繁琐、灵敏度低、耗时(＞2h)；精确检测一般采用gb/t5009.116-2003畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定(高效液相色谱法)方法，但需用到液相色谱仪等大型仪器，不适合快速检测，而且检测比较费时间；同时，对于复杂的多组分体系分离体系效率不够理想，而且由于大量使用有机溶剂，易对环境造成污染。而有的时候，食品安全、药品安全、饲料检测等要求进行现场的快速检测，并不需要精确的分析检测结果。因此，寻找一种简便、快捷、易于实时探测的抗生素检测新方法对于食品中抗生素污染的严格控制具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种基于sers检测鸡蛋中四环素类抗生素残留量的方法，该方法操作简便，快捷，易于实时探测，且可以进行定量分析。

解决上述技术问题的技术方案如下：

基于sers检测鸡蛋中四环素类抗生素残留的方法，所述的四环素类抗生素包括土霉素、四环素或金霉素，包括以下步骤：

（1）活性增强基底的制备

采用传统的微波加热方法制备银纳米溶胶颗粒，即在微波加热条件下，利用柠檬酸三钠还原硝酸银制备银溶胶，反应一段时间后，当银纳米溶胶的颜色由红色变为灰绿色时，停止加热并将银纳米溶胶取出，自然冷却至室温，乙醇5000r/min离心清洗至少3遍，于4℃保存备用；吸取10μl银纳米溶胶均匀附于丝网印刷电极的碳工作电极上，烘箱内60℃烘干，重复镀制三次，制成0.5cm×0.5cm银纳米镀膜作为sers活性增强基底；

（2）鸡蛋提取液样品的制备

取鸡蛋破壳，置于均质机内充分作用均匀，取5g均匀蛋液置于50ml离心管内，再加入5g无水硫酸钠和10ml丙酮，涡旋3min，超声10min，5000r/min离心5min，取上清液得鸡蛋提取液样品；

（3）静电富集和拉曼光谱检测

将步骤（1）制成的活性增强基底置入步骤（2）得到的鸡蛋提取液样品，对丝网印刷电极施加电压，所述的施压频率为30次/秒，丝网印刷电极的作用，一方面提供活性拉曼衬底的支撑衬底，另一方面，静电富集鸡蛋中抗生素；使得抗生素分子富集和吸附在丝网印刷电极的表面，置于拉曼光谱样品池中，调节拉曼光谱仪器的参数设置，获得sers光谱；

所述的拉曼光谱仪器的参数设置如下：光谱仪激光功率2mw，激光波长785nm，扫描光谱范围100-3200cm^-1，选择波段为150-1800cm^-1，信号相对强度范围为4000-25000，积分时间10s，积分平均2次；对测量数据进行记录待分析；

（4）含有四环素类抗生素的丙酮溶液的sers检测

制作工作标曲，分别使用标准溶液制备成土霉素、四环素、金霉素标准溶液0.2、0.4、0.8、1.2、2.0mg/l浓度点，拉曼光谱仪器的参数设置同步骤（3）；

通过对比不含四环素类的丙酮鸡蛋提取液、含有抗生素的丙酮提取液的不同浓度的工作标曲点，找出拉曼特最佳征峰位置，作为定量峰，根据四环素化学结构，选取同时具备拉曼光谱720、1178、1278、1357、1450、1560cm^-1为目标化合物四环素；同时具备拉曼光谱882、1271、1328、1437、1583cm^-1为目标化合物土霉素；同时具备拉曼光谱996、1116、1190、1312、1434、1578cm^-1为目标化合物金霉素；采用光谱处理数据分析软件labspec处理荧光背景，进行六峰积分和绘制工作曲线，积分绘制工作曲线，横坐标和纵坐标分别为样品标液浓度和拉曼特征峰的峰强（峰积分），最终选取1278cm^-1（四环素）、1271cm^-1（土霉素）、1116cm^-1（金霉素）为定量峰强度，曲线回归方程分别为y=247x+76、y=349x+10、y=289x+3.5，线性相关系数0.95、0.84、0.86，利用得到的标准曲线对质量为0.80mg/l的四环素空白加标样品进行检测，得到值为0.63mg/l、0.61mg/l、0.60mg/l，回收率为78.8%、76.3%、75.0%。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种基于sers检测鸡蛋中四环素类抗生素残留量的方法，简便、快捷、易于实时探测，且可以进行定量分析，对于食品中抗生素污染的严格控制具有重要的意义。

附图说明

图1为土霉素工作标曲的表面增强拉曼光谱图，其中a为不含四环素类的丙酮鸡蛋提取液，b为0.8mg/l土霉素提取液样品，c为1.2mg/l土霉素提取液样品；横坐标和纵坐标分别为样品标液浓度和拉曼特征峰的峰积分；

图2为四环素的工作标曲的表面增强拉曼光谱图，其中a为不含四环素类的丙酮鸡蛋提取液，b为0.8mg/l四环素提取液样品，c为1.2mg/l四环素提取液样品；横坐标和纵坐标分别为样品标液浓度和拉曼特征峰的峰积分；

图3为金霉素的工作标曲的表面增强拉曼光谱图，其中a为不含四环素类的丙酮鸡蛋提取液，b为0.8mg/l金霉素提取液样品，c为1.2mg/l金霉素提取液样品；横坐标和纵坐标分别为样品标液浓度和拉曼特征峰的峰积分；

图4为土霉素定量分析表面增强拉曼光谱图；横坐标和纵坐标分别为样品标液浓度和拉曼特征峰的峰积分；

图5为四环素定量分析表面增强拉曼光谱图；横坐标和纵坐标分别为样品标液浓度和拉曼特征峰的峰积分；

图6为金霉素定量分析表面增强拉曼光谱图；横坐标和纵坐标分别为样品标液浓度和拉曼特征峰的峰积分。

具体实施方式

（1）活性增强基底的制备

采用传统的微波加热方法制备银纳米溶胶颗粒，即在微波加热条件下，利用柠檬酸三钠还原硝酸银制备银溶胶，反应一段时间后，当银纳米溶胶的颜色由红色变为灰绿色时，停止加热并将银纳米溶胶取出，自然冷却至室温，乙醇5000r/min离心清洗至少3遍，于4℃保存备用；吸取10μl银纳米溶胶均匀附于丝网印刷电极的碳工作电极上，烘箱内60℃烘干，重复镀制三次，制成0.5cm×0.5cm银纳米镀膜作为sers活性增强基底；

（2）鸡蛋提取液样品的制备

取鸡蛋破壳，置于均质机内充分作用均匀，取5g均匀蛋液置于50ml离心管内，再加入5g无水硫酸钠和10ml丙酮，涡旋3min，超声10min，5000r/min离心5min，取上清液得鸡蛋提取液样品；

（3）静电富集和拉曼光谱检测

将步骤（1）制成的活性增强基底置入步骤（2）得到的鸡蛋提取液样品，对丝网印刷电极施加电压，所述的施压频率为30次/秒，丝网印刷电极的作用，一方面提供活性拉曼衬底的支撑衬底，另一方面，静电富集鸡蛋中抗生素；使得抗生素分子富集和吸附在丝网印刷电极的表面，置于拉曼光谱样品池中，调节拉曼光谱仪器的参数设置，获得sers光谱；

所述的拉曼光谱仪器的参数设置如下：光谱仪激光功率2mw，激光波长785nm，扫描光谱范围100-3200cm^-1，选择波段为150-1800cm^-1，信号相对强度范围为4000-25000，积分时间10s，积分平均2次；对测量数据进行记录待分析；

（4）含有四环素类抗生素的丙酮溶液的sers检测

制作工作标曲，分别使用标准溶液制备成土霉素、四环素、金霉素标准溶液0.2、0.4、0.8、1.2、2.0mg/l浓度点，拉曼光谱仪器的参数设置同步骤（3）；

通过对比不含四环素类的丙酮鸡蛋提取液、含有抗生素的丙酮提取液的不同浓度的工作标曲点，找出拉曼特最佳征峰位置，作为定量峰，根据四环素化学结构，选取同时具备拉曼光谱720、1178、1278、1357、1450、1560cm^-1为目标化合物四环素（如图2所示）；同时具备拉曼光谱882、1271、1328、1437、1583cm^-1为目标化合物土霉素（如图1所示）；同时具备拉曼光谱996、1116、1190、1312、1434、1578cm^-1为目标化合物金霉素（如图3所示）；采用光谱处理数据分析软件labspec处理荧光背景，进行六峰积分和绘制工作曲线，积分绘制工作曲线，横坐标和纵坐标分别为样品标液浓度和拉曼特征峰的峰强（峰积分）（如图4、5、6所示），最终选取1278cm^-1（四环素）、1271cm^-1（土霉素）、1116cm^-1（金霉素）为定量峰强度，曲线回归方程分别为y=247x+76、y=349x+10、y=289x+3.5，线性相关系数0.95、0.84、0.86，利用得到的标准曲线对质量为0.80mg/l的四环素、土霉素、金霉素空白加标样品进行检测，得到值为0.63mg/l、0.61mg/l、0.60mg/l，回收率为78.8%、76.3%、75.0%。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。