同时检测间苯二酚和2-硝基对苯二胺HPLC方法与流程

本发明属于化工领域，尤其是涉及一种同时检测间苯二酚和2-硝基对苯二胺hplc方法。

背景技术：

染发剂中常含有以苯、萘、蒽等芳环或杂环结构的染料或染料中间体(如硝基苯、苯胺、苯酚、氯苯和邻苯二甲酸酐等)，当染料与显色剂(氧化剂)混合涂于头发上，发生一系列化学反应后显色。染发剂中的染料大多具有一定毒性，但中最典型的为对苯二胺，它被广泛的使用在黑色染发剂中。染料能够通过头皮吸收到体内，长期使用会对身体健康产生危害，近年来关于染发剂的致突变、致过敏、致癌的研究报道已越来越多。chung等对染发剂中苯胺类衍生物的遗传毒性进行了研究，结果表明对苯二胺、邻苯二胺、对硝基苯胺、2－硝基－对苯二胺、3－硝基邻苯二胺和4-硝基邻苯二胺剂量为10μg·ml^－1时便可诱发原核细胞沙门菌回复突变，15μg·ml^－1时可使中国仓鼠卵巢细胞染色体畸变；gago－domingues等发现长期使用氧化型染色剂会增加膀胱癌的发病率。因此化妆品安全技术规范(2015版)中对苯二胺等32种为染发类化妆品致癌成分重要检测项。对苯二胺类32种成分共同的特点为水溶性强，分子量小，极易氧化。反相色谱具有峰形好，选择性高的特点，是对苯二胺类成分的首选。反相色谱保留能力弱加上对苯二胺类成分种类多，分离条件对色谱条件要求较高。

《化妆品安全技术规范》(2015版)中采用hplc-pda在rp-amide柱上为对苯二胺类32种成分进行分离和定量分析。其中在流动相ⅰ条件下标准的色谱条件间苯二酚和2-硝基对苯二胺无法实现完全分离，如图1所示，对于上述两个物质的准确定量存在问题。而且图1所示为较为理想色谱条件，色谱柱分离度稍差即可能造成基本不分离的情况，如图2所示。

关于对苯二胺类物质分析的资料众多。目前染料的测定方法包括气相色谱法、液相色谱法、气相色谱－质谱法、液相色谱－质谱法和薄层色谱法等。欧盟指令82/434/eec推荐的薄层色谱法虽能较好的分离和鉴别各组分，但对其进行准确的定量分析具有一定的难度。采用气相色谱法和气相色谱－质谱联用法测定时，对毛细管柱和仪器的污染比较严重，采用液相色谱－质谱法的仪器成本较高，不具备普遍推广意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种同时检测间苯二酚和2-硝基对苯二胺hplc方法，能够实现上述两个化学物质的准确测定。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种同时检测间苯二酚和2-硝基对苯二胺hplc方法，该方法的色谱柱采用amide柱，流动性中有机相为甲醇与乙腈，缓冲溶液采用ph＝5.5-6.5的庚烷磺酸钠磷酸盐缓冲液。

进一步，所述的甲醇与乙腈的体积比为1:0.8-1.2。

进一步，流动性中水相为水，有机相与水相的体积比为6-10:90-94。

进一步，所述的缓冲溶液中庚烷磺酸钠的浓度为0.7-0.8g/ml。

进一步，所述的缓冲溶液中含有十二水合磷酸氢二钠与磷酸二氢钾。

进一步，所述的色谱柱为suplecoamidec16250×4.6,5μm。

amide柱为小分子胺类物质分析专业色谱柱，染色剂中染色类物质主要为胺类物质，amide柱为分离和分析的首选。间苯二酚具有两个弱酸性基团。2-硝基对苯二胺的氨基集团具有弱碱性。二者极性相近，在色谱柱上的迁移行为相近，造成空间上允许二者之间发生分子间作用。常规方法用于分离间苯二酚和2-硝基对苯二胺的流动相中有机相为乙腈。乙腈对分子间氢键的干预很小，但是具有很好的扫尾作用，色谱分离度高。通过单纯降低有机相比例，间苯二酚和2-硝基对苯二胺仅出峰时间后移，色谱峰同时展宽，表现为分离度进一步下降。本发明将有机相中加入4％甲醇，抑制分子间相互作用。同时将水相比例调整为92％。

缓冲溶液ph＝6.0，同时使用庚烷磺酸钠为离子对试剂。ph＝6.0的使用为使庚烷磺酸钠以钠盐的形式存在发挥离子对作用。ph＝6.0为微酸性环境，能够对不同胺类物质的碱性进行区分。碱性较大的胺类更容易与庚烷磺酸钠生成瞬间离子对，色谱保留能力增加。本专利在上述分析的基础上采用ph＝6.0缓冲溶液并添加庚烷磺酸钠。色谱图显示部分显色剂保留时间较短，庚烷磺酸钠添加量不宜减少。增加庚烷磺酸钠的浓度可能造成2-硝基对苯二胺与其他胺类分离不理想。综上所述采用1g/ml为庚烷磺酸钠添加浓度。

相对于现有技术，本发明所述的同时检测间苯二酚和2-硝基对苯二胺hplc方法具有以下优势：

(1)本发明所述的同时检测间苯二酚和2-硝基对苯二胺hplc方法建立完全分离条件，能够实现上述两个化学物质的准确测定，对色谱柱要求比较低。

(2)本发明所述的同时检测间苯二酚和2-硝基对苯二胺hplc方法实现间苯二酚和2-硝基对苯二胺的完全分离，满足定性和定量的要求。

附图说明

图1为在流动相ⅰ条件下标准的色谱条件分离间苯二酚和2-硝基对苯二胺谱图(流动相ⅰ1：对苯二胺(4.958min)；2：对氨基苯酚(5.471min)；3：甲苯-2,5-二胺硫酸盐(6.213min)；4：间氨基苯酚(6.694min)；5：邻苯二胺(7.268min)；6：2-氯对苯二胺硫酸盐(8.391min)；7：邻氨基苯酚(9.166min)；8：间苯二酚(10.848min)；9：2-硝基对苯二胺(11.149min)；10:甲苯-3,4-二胺(13.547min)；11:4-氨基-2-羟基甲苯(14.072min)；12:2-甲基间苯二酚(16.359min)；13:6-氨基间甲酚(17.915min)；14:苯基甲基吡唑啉酮(21.117min)；15:n,n-二乙基甲苯-2,5-二胺盐酸盐(24.136min)；16:4-氨基-3-硝基苯酚(25.506min))；

图2为受色谱柱分离能力限制情况下目标物质分离谱图；

图3为实施例1的分离谱图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

实施例1

一种染发剂中同时检测间苯二酚和2-硝基对苯二胺hplc方法，包括如下步骤：分别称取对苯二胺、对氨基苯酚、甲苯-2,5-二胺硫酸盐、间氨基苯酚、邻苯二胺、2-氯对苯二胺硫酸盐、邻氨基苯酚、间苯二酚、2-硝基对苯二胺、甲苯-3,4-二胺、4-氨基-2-羟基甲苯、2-甲基间苯二酚、6-氨基间甲酚、苯基甲基吡唑啉酮、n,n-二乙基甲苯-2,5-二胺盐酸盐、4-氨基-3-硝基苯酚共十六种物质标准品，甲苯-3,4-二胺和2-硝基对苯二胺用乙醇溶解并定容，其余用2g/l亚硫酸氢钠水溶液和无水乙醇(1：1)的混合溶液溶解并定容，吸取上述溶液置同一容量瓶2g/l亚硫酸氢钠水溶液和无水乙醇(1：1)的混合定容得各物质浓度为500μg/ml各物质混标液，吸取上述溶液5μl注入液相色谱；

色谱柱：suplecoamidec16250×4.6,5μm；

流动相：水相：十二水合磷酸氢二钠1.8g、磷酸二氢2.8g和庚烷磺酸钠(c7h15so3na)1.0g，用水稀释至1l，混匀，制成含庚烷磺酸钠(1g/l)的磷酸盐缓冲液，用磷酸溶液调节ph至6；

有机相：乙腈：甲醇＝1:1；

有机相：水相＝8:92。

所得谱图如图3所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。