多蛋白组合生物标志物及应用与心脏瓣膜病并发心房颤动诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及多蛋白组合生物标志物及应用与心脏瓣膜病并发心房颤动诊断试剂盒。

背景技术：

心房颤动(房颤，af)是最常见的心律失常之一。房颤发生后，患者心房的有效收缩丧失，血液动力学改变，房室不同步，出现进行性心房心室功能障碍和血栓栓塞并发症，患者的死亡率增加。同时，房颤与中风，心肌梗死，心力衰竭，痴呆，慢性肾病等疾病的发生相关，且合并房颤能够增加疾病的死亡率。随着人口老龄化的加快，房颤患者将大量增加，给家庭和社会带来巨大的负担。

目前针对房颤的治疗包括抗心律失常药物治疗，电复律，射频消融等介入治疗和外科手术治疗。房颤转为窦性心律后易反复发作，甚至发展为慢性及永久性房颤，治疗效果并不明显。而房颤发生的机制尚不完全清楚，多种疾病，包括心源性疾病和非心源性疾病，可造成心房组织的结果和/或电生理异常，从而改变心脏的自律性，和出发活动，促进异常活动的形成和传播，进而导致房颤发生。

蛋白质是生命活动的主要承担者，不仅参与构建细胞的结构成分，还参与了几乎所有的细胞功能，传统的蛋白质研究需要将待研究的蛋白质分离提纯，再分析其化学结构和生物学活性，耗时耗力。蛋白质组学作为后基因组学的组成部分，可以从整体水平对多种蛋白进行鉴定并分析，这有助于寻找与房颤发生的有关分子机制，为发现安全有效的临床治疗奠定基础。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种多蛋白组合生物标志物。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述多蛋白组合生物标志物的应用。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种心脏瓣膜病并发心房颤动筛查试剂盒。

本发明采用的技术方案是：

一种多蛋白组合生物标志物，由载脂蛋白a1蛋白抗体、血管紧张素原抗体、lim结构域蛋白7、巨噬细胞集落刺激因子受体1、玻连蛋白抗体和凝血酶原片段f1+2抗体组成。

上述多蛋白组合生物标志物在制备心脏瓣膜病并发心房颤动检测制剂或医疗器械方面的应用。

优选的，上述多蛋白组合生物标志物的应用，所述医疗器械为心脏瓣膜病并发心房颤动筛查试剂盒。

一种应用上述多蛋白组合生物标志物的心脏瓣膜病并发心房颤动筛查试剂盒，包含6种蛋白检测组：

第一检测组包括：包被有载脂蛋白a1蛋白抗体的多孔板、载脂蛋白a1纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、样本稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，其中，

所述载脂蛋白a1标准品浓度为0,1.4,4,12,37,111,333,1000ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗载脂蛋白a1抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为86％氯化钠、4.5％磷酸氢二钠、3.5％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸；

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)取离体血浆样本，检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:8000倍稀释后进行检测；

2)标准品制备；

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.5小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

第二检测组包括：包被有玻连蛋白抗体的多孔板、玻连蛋白纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、样本稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，其中，

所述玻连蛋白标准品浓度为0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50，100ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗玻连蛋白抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸；

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:5000倍稀释后进行检测。

2)标准品制备。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加相应浓度标准品或待测样本50μl；

b)立即加入辣根过氧化物酶标记亲和素50μl，再按同样顺序加入生物素标记抗体50μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育50分钟；

c)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

d)每孔加底物溶液100μl，37摄氏度避光显色15分钟；

e)每孔加终止液50μl，终止反应；

f)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

第三检测组包括：包被有血管紧张素原抗体的多孔板、血管紧张素原蛋白纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、洗涤液、底物溶液和终止液，其中，

所述血管紧张素原蛋白标准品浓度0,78,156,312,625,1250,2500,5000pg/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗血管紧张素原抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温206ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:1000倍稀释后进行检测。

2)标准品制备；

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育2小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育50分钟；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

3)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

第四检测组包括：包被有凝血酶原片段f1+2抗体的多孔板、凝血酶原片段f1+2纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、样本稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，其中，

所述凝血酶原片段f1+2标准品浓度为0,0.03,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2nmol/l；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗凝血酶原片段f1+2抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为86％氯化钠、4.5％磷酸氢二钠、3.5％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，吐温20(0.5％)5ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250μl样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育2.5小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育50分钟；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

3)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

第五检测组包括：包被有巨噬细胞集落刺激因子受体1的多孔板，巨噬细胞集落刺激因子受体1纯品作为标准品，生物素标记抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，洗涤液，底物溶液，终止液，其中，

所述巨噬细胞集落刺激因子受体1标准品浓度为0,0.156,0.312,0.625,1.25,2.5,5,10ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗巨噬细胞集落刺激因子受体1抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min。

2)标准品制备。

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育2小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育50分钟；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

3)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

第六检测组包括：包被有lim结构域蛋白7的多孔板，lim结构域蛋白7纯品作为标准品，生物素标记抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，洗涤液，底物溶液，终止液，其中，

所述lim结构域蛋白7标准品浓度为0,1.56,3.12,6.25,12.5,25,50,100pg/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗lim结构域蛋白7抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min。

2)标准品制备。

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育2小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育50分钟；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

3)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

本发明的有益效果是：

本发明利用现代生物学技术和生物信息学分析对载脂蛋白a1，血管紧张素原，lim结构域蛋白7，巨噬细胞集落刺激因子受体1，玻连蛋白，和凝血酶原片段f1+2的检测及功能进行了初步研究，高浓度的lim结构域蛋白7和凝血酶原片段f1+2，低浓度载脂蛋白a1，血管紧张素原，巨噬细胞集落刺激因子受体1，和玻连蛋白具有预测心脏瓣膜病并发心房颤动的用途，可应用于制备靶向药物来早期干预；同时，依赖六种蛋白浓度分层分析还可应用于制备心脏瓣膜病并发心房颤动筛查试剂盒，对心脏瓣膜病并发心房颤动有着较好的评价效能和潜在的巨大应用价值。

附图说明

图1是蛋白质组学检测到的含有载脂蛋白a1和玻连蛋白等蛋白的网络互作图；

图2是elisa检测的载脂蛋白a1，血管紧张素原，lim结构域蛋白7，巨噬细胞集落刺激因子受体1，玻连蛋白，和凝血酶原片段f1+2在心脏病心房颤动患者和窦性患者中的含量，其中，

apolipoproteina-i：载脂蛋白a1；

angiotensinogen：血管紧张素原；

prothrombinfragment1+2：凝血酶原片段f1+2；

macrophagecolony-stimulatingfactor1recepor：巨噬细胞集落刺激因子受体1；

vitronectin：玻连蛋白；lmo-7：lim结构域蛋白7。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

1.人体血浆样本的收集

心脏病房颤患者为实验组，维持窦性心律的患者为对照组。所有患者(实验组及对照组)均在手术前一天早晨，禁食>10h的情况下进行血样采集。每位患者自周围静脉采全血2ml，立即于2500rpm离心10分钟，分离上层血浆。再将分离的血浆分为数等份，置于血浆收集管中，置于-80摄氏度冰箱冻存待检。

2.蛋白质组学检测

1)血浆蛋白质组检测

采用itraq联合多维液相色谱-质谱联用技术(lc-ms/ms)(appliedbiosystems,fostercity,ca)检测两组各混合样本中的蛋白质。

2)样品制备

a)购买高丰度蛋白去除试剂盒(proteoextracttmalbumin/iggremovalkit,calbiochem,usa)，去除高丰度蛋白。

b)加入5倍体积的丙酮，-20℃沉淀1小时。4℃，10000g离心10分钟，收集沉淀。

c)将干燥后的粉末溶解液于样品裂解液中，30℃恒温水浴充分溶解蛋白。

d)将溶液在室温下15000g离心15min，取上清，并再次离心取上清，充分去除不容性杂质。

e)上清即为组织的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用或直接用于itraq分析。

3)样品定量

样品按定量原理：bca(bicinchoninincacid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即bca工作试剂。在碱性条件下，bca与蛋白质结合时，蛋白质将cu2+还原为cu+，一个cu+螯合二个bca分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，该水溶性的复合物在562nm处显示最大吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

按照bca方法定量样品中蛋白质。实验步骤如下：

a)以标准蛋白浓度为横坐标，od562为纵坐标制作标准曲线图，求出回归方程。

b)用od562的值对bsa浓度做标准曲线。

c)取适量体积的待测样品稀释10倍，检测样品吸光度，计算其平均od562，代入回归方程，最后计算出待测样品的测得浓度，测得浓度乘以10后即为样品的真实浓度。

4)sds-page电泳样品检测实验

a)每个样品取10μg，采用12％sds-page进行分离。

b)分离后的凝胶采用考马斯亮兰染色法进行染色。具体操作如下：固定2小时；染色12小时；水洗至背景清晰。

c)染色后的凝胶应用imagescanner扫描仪进行扫描，扫描模式为灰度模式，光密度值为300dpi。

5)蛋白还原烷基化及酶解

具体步骤如下：

a)蛋白定量后每个样品各取100μg，采用5倍体积预冷丙酮进行沉淀，-20℃放置1小时，充分沉淀蛋白。

b)4℃，12,000rpm离心10分钟，取沉淀真空冷冻干燥。

c)采用50μlitraq试剂盒中的dissolutionbuffer充分溶解蛋白沉淀，加入4μlreducingreagent，60℃反应1小时。

d)加入2μlcysteine-blockingreagent，室温反应10分钟，将还原烷基化后的蛋白溶液加入10k的超滤管中，12,000rpm离心20分钟，弃掉收集管底部溶液。

e)加入100μldissolutionbuffer，12,000rpm离心20分钟，弃掉收集管底部溶液，重复3次。

f)更换新收集管，在超滤管中加入50μl浓度为50ng/μl的测序级胰蛋白酶溶液，37℃反应12小时。

g)12,000rpm离心20分钟，收集酶解后肽段，在超滤管中再加入50μldissolutionbuffer，12000rpm离心20分钟，收集管底溶液并与前次溶液合并。

6)蛋白标记及质谱预实验

a)从冰箱中取出itraq试剂，平衡到室温；

b)将itraq试剂离心至管底；

c)用150μl异丙醇溶解itraq试剂；

d)取50μl样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中，加入itraq试剂后室温反应2小时；

e)加入100μl水终止反应；

f)混合所有标记样品，涡旋振荡，离心至管底；

g)真空冷冻干燥样品，留作itraq分离鉴定。

7)2d-lc-msms分析反相色谱分离

a)冷冻干燥后的样品用110μl流动相a溶液溶解；

b)肽段分离在agilent1200hplc上进行，购买色谱柱agilent公司色谱柱，具体参数为：保护住芯：analyticalguardcolumn4.6*12.5mm5-micron.分离柱：narrow-bore2.1*150mm5μm，检测波长：紫外210nm和280nm；流速：0.3ml/min，非线性二元梯度。

肽段色谱分离流动相比例时间表见表1。

表1

c)0-5分钟丢弃，6-45分钟每4.5分钟收集1管，46-50分钟收集成1管，总共10管样品溶液，然后将每管溶液彻底冷冻干燥。得到一维分离色谱图。

反向色谱-tripletof分析

a)将阳离子交换分离后冻干的多肽样品重新溶解于nano-rplcbuffera中。

b)在线nano-rplc液相色谱在eksigentnanolc-ultra2d系统(absciex)进行，溶解后的样品以2l/min的流速上样到c18预柱上(100m×3cm，c18,3m,150)，然后保持流速冲洗脱盐10min。

c)分析柱是c18反相色谱柱(75μmx15cmc18-3μm120,chromxpeksigent)，实验所用梯度为70min内流动相b由5％升高至35％。

d)质谱采用tripletof5600系统(absciex)结合纳升喷雾iii离子源(absciex,usa)，喷雾电压为2.5kv，气帘气压为30psi，雾化气压为5psi，加热器温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(ida，informationdependentanalysis)，一级tof-ms单张图谱扫描时间为250ms，每次ida循环下最多采集35个电荷为2+到5+且单秒计数大于150的二级图谱，每次循环时间固定为2.5秒，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离(cid)，动态排除设置为18秒，约等于色谱半峰宽。

8)数据库检索

数据处理采用含paragonalgorithm算法的proteinpilotsoftwarev.5.0(absciex,usa)软件进行，本次实验使用的数据库为人数据库，数据库来源于uniprot。蛋白质鉴定主要是通过实验串联质谱数据与数据库模拟得到的理论质谱数据进行匹配，从而得到蛋白质鉴定结果。设置参数如下：

蛋白质组质谱检索参数

sampletype:itraq8plex(peptidelabeled)

cys.alkylation:iodoacetamide

digestion:trypsin

instrument:tripletof5600

database:homosapiens.fasta

searcheffort:thorough

usermodifiedparameterfiles:no

蛋白质组学检测到的含有载脂蛋白a1,玻连蛋白等差异蛋白的网络互作图见图1。

实施例2

酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)

采用elisa法在新收取的血浆样本中对载脂蛋白a1，血管紧张素原，lim结构域蛋白7，巨噬细胞集落刺激因子受体1，玻连蛋白，和凝血酶原片段f1+2进行了验证。

实验原理：待测蛋白的抗体预埋于96孔板底部，标准品和样品加入后，其中的待测蛋白会与抗体结合。在去除未结合的基他底物后，加入待测蛋白的生物素共轭抗体。冲洗，加入抗生物素共扼辣根过氧化物酶标记抗体(hrp)，通过冲洗去除未结合的hrp。加入显色剂，终止反应后，测量液体的吸光度。

验证载脂蛋白a1，包含：

包被有载脂蛋白a1抗体的多孔板

载脂蛋白a1纯品作为标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

生物素标记抗体稀释液

辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液

样本稀释液

洗涤液

底物溶液

终止液

其中

所述载脂蛋白a1标准品浓度为0,1.4,4,12,37,111,333,1000ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗载脂蛋白a1抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为86％氯化钠、4.5％磷酸氢二钠、3.5％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸；

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)取离体血浆样本，检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:8000倍稀释后进行检测；

2)标准品制备；

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.5小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

验证玻连蛋白，包含：

包被有玻连蛋白抗体的多孔板

玻连蛋白纯品作为标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

生物素标记抗体稀释液

辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液

样本稀释液

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述玻连蛋白标准品浓度为0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50，100ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗玻连蛋白抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸；

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:5000倍稀释后进行检测。

2)标准品制备。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加相应浓度标准品或待测样本50μl；

b)立即加入辣根过氧化物酶标记亲和素50μl，再按同样顺序加入生物素标记抗体50μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育50分钟；

c)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

d)每孔加底物溶液100μl，37摄氏度避光显色15分钟；

e)每孔加终止液50μl，终止反应；

f)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

验证血管紧张素原蛋白，包含：

包被有血管紧张素原抗体的多孔板

血管紧张素原纯品作为标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述血管紧张素原蛋白标准品浓度0,78,156,312,625,1250,2500,5000pg/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗血管紧张素原抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温206ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:1000倍稀释后进行检测。

2)标准品制备；

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育2小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育50分钟；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

3)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

验证凝血酶原片段f1+2，包含：

包被有凝血酶原片段f1+2抗体的多孔板

凝血酶原片段f1+2纯品作为标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述凝血酶原片段f1+2标准品浓度为0,0.03,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2nmol/l；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗凝血酶原片段f1+2抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为86％氯化钠、4.5％磷酸氢二钠、3.5％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，吐温20(0.5％)5ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250μl样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育2.5小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育50分钟；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

3)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

验证巨噬细胞集落刺激因子受体1，包含：

包被有巨噬细胞集落刺激因子受体1抗体的多孔板

巨噬细胞集落刺激因子受体1纯品作为标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述巨噬细胞集落刺激因子受体1标准品浓度为0,0.156,0.312,0.625,1.25,2.5,5,10ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗巨噬细胞集落刺激因子受体1抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min。

2)标准品制备。

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育2小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育50分钟；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

3)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

验证lim结构域蛋白7，包含：

包被有lim结构域蛋白7抗体的多孔板

lim结构域蛋白7纯品作为标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

洗涤液

底物溶液

终止液

其中，

所述lim结构域蛋白7标准品浓度为0,1.56,3.12,6.25,12.5,25,50,100pg/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗lim结构域蛋白7抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min。

2)标准品制备。

3)操作步骤：

a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育2小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育50分钟；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

3)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

综上通过实施例1，载脂蛋白a1的功能为参与胆固醇逆向转运，将肝外组织细胞的胆固醇通过血液循环转运回肝，转化为胆汁酸排除，还可以激活卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶，识别hdl受体。心房颤动组血浆载脂蛋白a1降低，提示心房颤动可能影响了体内的脂质代谢。血管紧张素2可促进心房组织的凋亡和细胞外基质沉淀，最终导致房颤的发生。血管紧张素原是血管紧张素2的重要来源，血管紧张素2的增加与血管紧张素原高升高有关。玻连蛋白是存在于血液循环和组织中的糖蛋白，主要参与细胞粘附，细胞溶解，信号通路调节和凝血等生物学过程，玻连蛋白可以抑制成纤维细胞增生，减少心脏纤维化。房颤的发生可以促进血栓的发生。凝血酶原可促进纤维蛋白员转化为纤维蛋白，正向调节凝血。巨噬细胞集落刺激因子受体1可以激活pi3k-akt信号通路，后者起糖代谢及细胞骨架调节作用，敲除pi3k的小鼠可发生房颤，同时发生心功能减退，心房扩大，和纤维化。房颤患者中巨噬细胞集落刺激因子受体1的浓度低于窦性心律患者，可能与pi3k-akt的活性降低有关。lim结构域蛋白7对哺乳动物的心脏发育有关，特别是对传导系统有重要作用。

针对实施例1中蛋白质组学对于心脏瓣膜病并发心房颤动患者的筛查诊断的结果，实施例2采用elsia方法再次证实了与对照组相比，心房颤动患者lim结构域蛋白7和凝血酶原片段f1+2浓度升高，载脂蛋白a1，血管紧张素原，巨噬细胞集落刺激因子受体1，和玻连蛋白浓度降低。结果与实施例1一致，见图2。

以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。