一种基于ELISA法检验猪肺炎支原体灭活疫苗体外效力的方法与流程

本发明属于动物用生物制品检验技术领域，具体涉及一种基于间接竞争抑制elisa检测方法检验猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）体外相对效力的方法。

背景技术：

猪支原体肺炎（mps）俗称猪喘气病，又称猪地方流行性肺炎，是一种由猪肺炎支原体引起的慢性接触性呼吸道传染病。猪支原体肺炎临床症状主要为咳嗦和气喘，一般患猪死亡率不高，但严重降低饲料转化率，长期生长发育不良，造成巨大的经济损失。目前，免疫接种猪肺炎支原体疫苗是防控mps的重要措施之一，疫苗接种可有效减少肺部损失、提高饲料转化率、缩短出栏时间。

目前，市场上有多家国内外疫苗公司均在生产和销售猪肺炎支原体灭活疫苗。目前，传统的检验猪肺炎支原体灭活疫苗体外相对效力的方法为攻毒保护试验，即猪只免疫疫苗后通过强毒攻击，通过与对照组相比，以确定疫苗的保护效力。此方法虽然可以直观的评价疫苗的体外效力，但是却存在动物试验历时时间长，而且试验期间需要进行攻毒，存在生物安全风险，并且会因动物的种属、窝别、年龄、体重、性别、健康状况、饲养环境及饲料营养等诸多因素，直接影响到检测结果的准确性及可靠性，不可避免地影响到检测的重复性；以及试验成本较高，效力检验使用动物、操作人员、攻毒菌液制备、饲养环境等条件导致攻毒保护试验批间差异较大的缺陷。更重要的是，此方法检测及出结果周期长达2个月之久，不仅延长了新疫苗的研发周期也间接缩短了疫苗的有效期，增加了疫苗库存压力，导致严重影响了疫苗的生产及销售。因此，开发新的对猪肺炎支原体灭活疫苗效力检测的方法，使之满足快速、灵敏、重复性好的要求，将有利于提高检测结果的可靠性，进一步保证产品质量，具有积极的意义。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于间接竞争抑制elisa检测方法检验猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）体外相对效力的方法，该检测方法操作简单、特异性好、敏感性高、耗时短的优势，可以取代传统的猪体内效力动物试验，已解决受试动物所带来的影响因素多、重复性差、检定周期长达2个月的不利因素，同时也可以减少生产线疫苗库存量多，延长疫苗的有效期，保证疫苗的品质，降低检定成本及劳动强度，提高检测效率，两天完成疫苗的体外相对效力全部试验及数据整理和判定结果，可实现高通量疫苗效力检测；

本发明所要解决的第二个问题在于提供用于建立以上所述检测方法的参考疫苗制备方法及长期稳定保存的条件；

本发明所要解决的第三个问题在于提供建立以上所述的检测方法的竞争支原体包被抗原、阳性血清和阴性血清的制备方法；

本发明所要解决的第四个问题在于提供用于建立以上所述检测方法的待检疫苗和参考疫苗稀释方法；

本发明所要解决的第五个问题在于提供用于建立以上所述检测方法的全程孵育时间的确定方法；

本发明所要解决的第六个问题在于提供用于建立以上所述检测方法的全程稀释液的确定方法；

本发明所要解决的第七个问题在于提供用于建立以上所述检测方法的检测结果的计算和分析方法；

本发明所要解决的第八个问题在于提供用于建立以上所述检测方法在制备猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）中的用途。

为解决上述技术问题，本发明所述的基于elisa法检验猪肺炎支原体灭活疫苗体外效力的方法，包括如下步骤：

（1）取待测的猪肺炎支原体灭活疫苗和经检验的参考疫苗，备用；

（2）将纯化的猪肺炎支原体包被抗原用包被液进行稀释，加至酶标板中进行包被处理，结束后洗板，并加入封闭液进行恒温培养箱孵育，洗板后备用；

（3）将不同来源的待测疫苗和参考疫苗分别加入上述处理后的酶标板不同的孔中，并在另外的空白孔中分别加入检测一抗、标准阴性血清、标准阳性血清及空白对照；

（4）将上述加样后的酶标板置于恒温培养箱孵育，洗板后各孔分别加入hrp标记的酶标检测二抗，进行恒温培养，洗板后加入显色液，于室温避光孵育后，加入终止液以终止反应；

（5）将各孔反应液于450nm条件下测定其od值，并将经过计算后的od450nm值输入relpot4.0软件计算rp值，以获得抗原含量之间的数值关系值以及数值关系图，以判断疫苗的体外相对效力是否合格。

具体的，所述步骤（1）中，所述参考疫苗为经检验合格的攻毒试验最小保护量抗原的疫苗。

具体的，所述步骤（2）中：

控制所述猪肺炎支原体的稀释浓度为20±5μg/ml，控制加液量为100μl/孔，控制所述包被处理步骤的温度为4℃包被16-18小时；

控制所述封闭液的加液量为100μl/孔，于37±2℃恒温培养1-2小时。

具体的，所述步骤（3）中，所述待测疫苗和所述参考疫苗的加液量为200μl/孔。

具体的，所述步骤（3）中：

所述检测一抗为pbs稀释的兔抗猪肺炎支原体阳性血清；

所述标准阴性血清为pbs稀释的兔抗猪肺炎支原体阴性血清；

所述标准阳性血清为pbs稀释的兔抗猪肺炎支原体阳性血清；

所述空白对照为pbs。

具体的，所述步骤（3）中，还包括将所述参考疫苗和/或待测疫苗进行梯度稀释后加入至所述酶标板中进行不同浓度检验的步骤。

具体的，所述步骤（3）中，所述稀释梯度为原倍、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64和1：128的2倍系列倍比稀释所得。

具体的，所述步骤（4）中：

所述酶标检测二抗为pbs稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，加液量为100μl/孔；

所述显色液的加液量为100ul/孔；

所述终止液的加液量为50ul/孔。

具体的，所述步骤（5）中，试验有效性判定包括：

a：阳性对照od450nm平均值应在0.7-2.0范围之内；

b：阴性对照od450nm平均值应＜0.4；

c：试验无效标准：如果上述标准中有一条不符合，试验无效。

具体的，所述步骤（5）中，所述疫苗合格的判定标准为：

a：符合试验有效标准；

b：设定参考疫苗rp值为1.0，待检疫苗rp值应≥1.0，待检疫苗相对效力合格；

c：如待检疫苗rp值＜1.0，应重检1次；待重检结果的rp值≥1.0，判待检疫苗相对效力合格，否则判待检疫苗相对效力不合格。

本发明所述基于间接竞争抑制elisa方法检测猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）体外相对效力的方法，使用猪肺炎支原体dj-166株接种适宜培养基培养，收获的培养物经浓缩纯化后经硫柳汞灭活制备抗原及灭活参考疫苗，通过将待检疫苗与参考疫苗进行间接竞争抑制elisa抗原检测即体外相对效力elisa检测。本发明所述检测方法，操作简单、耗时短，具有良好的灵敏性和特异性，检测结果稳定性、特异性和重复性好，是一种方便、快捷、特异、灵敏符合发展趋势的效力测定方法。

本发明所述检测猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）体外相对效力方法，具有良好的灵敏性和特异性，可以检测抗原含量区间为2ug/ml-5000ug/ml，并实现高通量检测，完全可以满足疫苗生产的体外效力检测技术需要，且与常见的几种猪病毒pcv2、ppv、prv、tgev、pedv、csfv和prrsv均无交叉反应。本发明所述检测猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）体外相对效力方法，只需约6小时即可完成疫苗相对效力检测，有效减少了疫苗库存量且延长了疫苗的有效期，降低了疫苗生产的成本和动物试验劳动强度，尤其在疫苗紧张时可增加生产疫苗量，可创造更多的产值。本发明所述方法可以对疫苗相对效力进行全程监测，克服因使用试验动物所带来的影响因素多、重复性差、检定周期长达2个月的不利因素，以及试验中途动物意外死亡等各种影响因素的影响，可彻底取代传统的猪只体内疫苗相对效力检测方法，对于进一步保证疫苗质量有重要意义。

本发明所述检测猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）体外相对效力方法，采用双平行线生物检定原理，做出的间接竞争抑制elisa检测猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）体外相对效力，待检疫苗稀释度（原倍、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64和1：128）与相对应od450nm值的对数之间表现出良好的线性回归r²在0.99以上，经软件计算后rp值均在1.0以上且斜率（slopescore）均在0.97以上，检测结果表现出较好的特异性性及重复性，是一种方便操作、快捷完成、结果可靠的检测方法，可以成为猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）生产中动物试验检测疫苗相对效力的替代方法，具有积极的推广价值。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为包被抗原与检测一抗（兔抗猪肺炎支原体阳性血清）方阵滴定，p/n值较高结果图；

图2为检测一抗（兔抗猪肺炎支原体阳性血清）与检测二抗方阵滴定，p/n值较高结果图；

图3为最佳封闭时间优化，p/n值较高结果图；

图4为最佳检测疫苗与检测一抗孵育时间优化，p/n值较高结果图；

图5为最佳检测二抗孵育时间优化，p/n值较高结果图；

图6为最佳显色时间优化，p/n值较高结果图；

图7为待检疫苗zyt-191体外对效力rp值图；

图8为待检疫苗zyt-191体外对效力斜率（slopescore）图；

图9为待检疫苗zyt-192体外对效力rp值图；

图10为待检疫苗zyt-192体外对效力斜率（slopescore）图。

具体实施方式

本发明下述实施例中，涉及的包被液（碳酸盐缓冲液cbs浓度0.05mol/l，ph值9.6）、pbs（磷酸盐缓冲液）、pbst（含千分之五吐温80的磷酸盐缓冲液）、封闭液（含5%脱脂奶粉的pbs）、检测一抗及检测二抗稀释液pbs（磷酸盐缓冲液）、显色液、终止液均为现有技术的常规用液。

实施例1

本实施例用于制备猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）及其参考疫苗（批号zytck-1801）。

猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）参考疫苗（批号：zytck-1801）为申请人严格按现行《中国兽药典》标准生产，待检的猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）（批号：zyt-191、zyt-192）也为申请人严格按现行《中国兽药典》标准生产。

参考疫苗zytck-1801和待检的猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）（批号：zyt-191、zyt-192）用猪肺炎支原体dj-166株接种适宜培养基培养，收获培养物，浓缩纯化后经硫柳汞灭活制备抗原，配制多个抗原浓度梯度，分别加入适宜佐剂乳化成疫苗。

参考疫苗质控

性状：淡黄色或浅白色液体，久置后下层有沉淀，振摇后呈均匀混悬液；

装量检查：按现行《中国兽药典》进行检验，应符合规定；

无菌检验：按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长；

按现行《中国兽药典》进行性状（淡黄色）、装量检查（符合规定）、无菌验（无菌生长）均符合规定。

参考疫苗的安全检验和效力检验

安全检验：用3-4周龄健康易感猪5头，各颈部肌肉注射疫苗4.0ml，连续观察14日。应不出现因注射疫苗引起的全身和局部不良反应（若有体温反应，注射后2日内试验猪体温应不超过基础体温的1.5℃）；

效力检验：用3-4周龄健康易感猪10头，分为2组，每组5头。第1组为免疫组，每头颈部肌肉注射疫苗2.0ml，第2组为攻毒对照组，各组猪隔离饲养。免疫后28日，免疫猪和攻毒对照猪分别用猪肺炎支原体检验用强毒hb株进行攻毒，每头气管注射10ml（100mid，含0.4g病肺组织），各组猪隔离饲养，饲料中无抗生素。攻毒后25-28日剖杀，按28分计分法，记录猪肺炎病变分数，并计算肺炎病变减少率。免疫组猪肺炎病变减少率达到60%及以上判疫苗效力检验合格。按发病判定标准进行判定：免疫猪肺炎病变减少率达到60%及以上及攻毒对照猪应至少4头肺炎病变的最低抗原含量的疫苗即可作为参考疫苗。

肺炎病变减少率=（对照猪肺炎算术平均分－免疫猪肺炎算术平均分/对照猪肺炎算术平均值）×100%。

贮藏与有效期：-70℃以下保存，有效期为四年。

实施例2

本实施例中支原体竞争包被抗原的制备方法包括如下步骤：将猪肺炎支原体dj-166株浓缩纯化菌液，经灭活、离心、经tritonx-100和ki溶液结合处理制成。用于猪肺炎支原体灭活疫苗（dj-166株）体外相对效力检测间接竞争抑制elisa试验包被抗原。

包被抗原质控

性状：溶解摇匀后，为乳白色液体；

无菌检验：应无菌生长；

效价测定：与猪肺炎支原体阳性血清进行琼脂扩散试验，琼扩效价应不低于1：2；

蛋白浓度测定：采用商品化的bca试剂盒进行检测，蛋白浓度应不低于1.0mg/ml；

特异性：与猪肺炎支原体阳性血清应出现清晰的白色沉淀线，与猪絮状支原体和猪鼻支原体阳性血清均应不出现任何沉淀线。

贮藏与有效期：70℃以下保存，有效期为三年。

实施例3

本实施例中阳性血清的制备方法包括如下步骤：将猪肺炎支原体灭活疫苗免疫健康兔，免疫后2周以同样剂量和途径加强接种1次，当琼扩抗体效价不低于1：16时，无菌采血、分离血清、过滤除菌、灭活纯化后经冷冻真空干燥制成。用于猪肺炎支原体灭活疫苗（dj-166株）体外相对效力检测间接竞争抑制elisa试验用阳性血清，可批量冻干。

阳性血清冻干品质控标准

性状：应为白色海绵状疏松团块；

无菌检验：应无菌生长；

效价测定：与猪肺炎支原体抗原进行琼脂扩散试验，琼扩效价应不低于1：2；

特异性：与猪肺炎支原体抗原应出现清晰的白色沉淀线，呈阳性反应，与猪絮状支原体和猪鼻支原体抗原均应不出现任何沉淀线，呈阴性反应；

剩余水分测定：剩余水分含量应≤4.0%；

真空度测定：应5/5呈紫色或者白色辉光。

贮藏与有效期：-70℃以下保存，有效期为五年。

本实施例中阴性血清的制备方法包括如下步骤：经无菌采集健康兔心脏血，离心分离血清，过滤除菌、灭活后进行冷冻真空干燥制成。用于猪肺炎支原体灭活疫苗（dj-166株）体外相对效力检测间接竞争抑制elisa试验用阴性血清，可批量冻干。

阴性血清冻干品质控标准

性状：应为白色海绵状疏松团块；

无菌检验：应无菌生长；

效价测定：按标示量稀释后，与猪肺炎支原体抗原进行琼脂扩散试验，应不出现任何沉淀线；

特异性：按标示量稀释后，与猪肺炎支原体、猪絮状支原体和猪鼻支原体抗原应均应不出现任何沉淀线；

剩余水分测定：剩余水分含量应≤4.0%；

真空度测定：应5/5呈紫色或者白色辉光。

贮藏与有效期：-70℃以下保存，有效期为五年。

实施例4

本实施例所述基于间接竞争抑制elisa检测方法检验猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）体外相对效力的方法的建立及优化，具体包括如下步骤：

（1）将支原体包被抗原用包被液（碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，三蒸水加至1l配置）稀释为20ug/ml，加至96孔酶标板中，100ul/孔，4℃包被16-18小时；恢复室温后，用pbst（含千分之五吐温80的磷酸盐缓冲液）洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；随后，加入封闭液含5%脱脂奶粉的pbs（磷酸盐缓冲液），100μl/孔，37℃恒温培养箱孵育，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；

（2）将制备的参考疫苗、待检疫苗即待检测抗原在稀释板内稀释，在所述96孔板上的a3、a4、a5孔各加入200μl参考疫苗，并在a6、a7、a8孔中各加入待检疫苗1（zyt-191），a9、a10、a11孔中各加入待检疫苗2（zyt-192），加液量为每孔200μl；

其余各孔（即b3-b11至h3-h11）分别加入100μlpbs，分别以连续2倍的倍比稀释所述参考疫苗和待检疫苗（纵向），转移每孔液体50μl至猪肺炎支原体包被的96孔反应板相应孔。将上述a3-a11至h3-h11各孔，每孔加入50μl检测一抗（用pbs稀释的兔抗猪肺炎支原体阳性血清）；第a1-h1、a2-h2和a12-h12列分别加入标准阴性对照（用pbs稀释为1：4兔抗猪肺炎支原体阴性血清）、标准阳性对照（用pbs稀释为1：50兔抗猪肺炎支原体阳性血清）和空白对照（pbs）；

（3）反应板置摇床上以100r/min的转速在37℃恒温培养箱孵育，随后洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；随后加入用pbs稀释的hrp标记的酶标检测二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗），100ul/孔，37℃恒温培养箱孵育1小时，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干。拿出tmb显色液恢复至室温，控制加液量100ul/孔，加入上述酶标板，室温避光孵育显色；反应结束后，控制加液量100μl/孔加入终止液终止反应。

将上述各孔的反应液于450nm条件下测定od450nm值，并进行计算。

为了确定出最佳反应条件，本实施例在不同反应条件下，对包被抗原与检测一抗以及检测一抗与检测二抗分别系列稀释后做方阵滴定，以p/n值较高且r²达到0.99以上为评价指标，确定它们的最佳使用浓度，测定结果分别见附图1和2所示。

在确定上述最佳检测一抗和检测二抗的使用浓度后，基于上述浓度下参数分别检测整个方法中，上述封闭液、检测疫苗与检测一抗、检测二抗不同孵育时间（30min、60min、90min和120min）对检测效果的影响，选取p/n值较高者作为最佳的孵育时间；最后测定不同显色时间（10min、15min和20min）对间接竞争抑制elisa检测效果的影响，同样选取p/n值较高者作为最佳的显色时间。经测定，各步骤的最佳反应时间结果分别见附图3-6所示。

经试验，确定支原体包被抗原的最佳包被浓度为20ug/ml；检测一抗最佳稀释倍数为1：25；检测二抗最佳稀释倍数为1：15000；封闭、检测一抗、检测二抗及显色液的最佳作用时间分别为1.5h、1.5h、1h和15min。根据上述最佳作用条件，确定参考疫苗和待检疫苗的最佳稀释方式为，进行浓度梯度稀释原倍、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64和1：128等2倍系列倍比稀释所得。

实施例5

本实施例所述基于间接竞争抑制elisa检测方法检验猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）体外相对效力的方法的具体实施。

将支原体包被抗原用包被液稀释为20ug/ml，加至96孔酶标板中，100ul/孔，4℃包被16-18小时；恢复室温后，用pbst（含千分之五吐温80的磷酸盐缓冲液）洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；随后，加入封闭液含5%脱脂奶粉的pbs（磷酸盐缓冲液），100μl/孔，37℃恒温培养箱孵育1.5小时，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干。

将制备的参考疫苗、待检疫苗即待检测抗原在稀释板内稀释，在所述96孔板上的a3、a4、a5孔各加入200μl参考疫苗，并在a6、a7、a8孔中各加入待检疫苗1（zyt-191），a9、a10、a11孔中各加入待检疫苗2（zyt-192），加液量为每孔200μl。

其余各孔（即b3-b11至h3-h11）分别加入100μlpbs，分别以连续2倍的倍比稀释所述参考疫苗和待检疫苗（纵向），转移每孔液体50μl至猪肺炎支原体包被的96孔反应板相应孔。将上述a3-a11至h3-h11各孔，每孔加入50μl检测一抗（用pbs稀释为1：25兔抗猪肺炎支原体阳性血清）；第a1-h1、a2-h2和a12-h12列分别加入标准阴性对照（用pbs稀释为1：4兔抗猪肺炎支原体阴性血清）、标准阳性对照（用pbs稀释为1：50兔抗猪肺炎支原体阳性血清）和空白对照（pbs）。各孔加样示意图见下表1所示。

表1待检疫苗zyt-191、待检疫苗zyt-192测定的od450nm值加样示意图

反应板置摇床上以100r/min的转速在37℃恒温培养箱孵育1.5小时，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干。随后加入用pbs稀释15000倍的hrp标记的酶标检测二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗），100ul/孔，37℃恒温培养箱孵育1小时，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干。拿出tmb显色液恢复至室温，控制加液量100ul/孔，加入上述酶标板，室温避光孵育15分钟；反应结束后，控制加液量100μl/孔加入终止液终止反应。

将上述各孔的反应液于450nm条件下测定od450nm值，并根据测定的od450nm值，进行下列计算：

（1）a1-h1孔阴性对照od450nm值相加取平均值即阴性对照od450nm平均值；

（2）a2-h2孔阳性对照od450nm值相加取平均值即阳性对照od450nm平均值；

（3）a9-h9孔空白对照od450nm值相加取平均值即空白对照od450nm平均值。

将参考疫苗、待检疫苗各三孔重复的8个不同稀释度的od450nm值分别减去空白对照od450nm平均值，计算出的数值，输入relpot4.0软件，进行待检疫苗的相对效力rp值、斜率（slopescord）计算。

结果判断

试验有效性判定包括：

a：阳性对照od450nm平均值应在0.7-2.0范围之内；

b：阴性对照od450nm平均值应＜0.4；

c：试验无效标准：如果上述标准中有一条不符合，试验无效。

疫苗合格判定标准包括：

a：符合试验有效标准；

b：设定参考疫苗rp值为1.0，待检疫苗rp值应≥1.0，待检疫苗相对效力合格；

c：如待检疫苗rp值＜1.0，应重检1次；重检结果的rp值≥1.0，判待检疫苗相对效力合格；否则判待检疫苗相对效力不合格。

根据各孔反应液测定的od450nm值，得如下表2中数据。

表2待检疫苗zyt-191、待检疫苗zyt-192的od450nm值

根据上述表2数据计算，对照od450nm平均值1.128，阴性对照od450nm的平均值0.083，空白对照od450nm的平均值0.065，对照成立，本次试验有效。

将上述参考疫苗、待检疫苗的od450nm值减去空白对照od450nm平均值，输入relpot4.0软件进行相体外对效力rp值及斜率（slopescore）计算，结果如下表3及附图7、8、9和10所示，其中，图7中rp：1.27，图9中rp：1.13。

表3待检疫苗体外对效力rp值及斜率（slopescore）

根据上述结果判定：待检疫苗zyt-191的rp1.27，斜率0.97；待检疫苗zyt-192的rp值1.13，斜率0.99。以zytck-1801为参考疫苗，检测待检疫苗zyt-191和zyt-192体外相对效力试验合格。

实施例6

本实施例对待检疫苗抗原含量与反应od450nm值的线性关系进行评价。

用本发明方法对待检猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）进行三次平行检测，以待检疫苗稀释度（原倍、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64和1：128）为纵坐标、相对应的od450nm值及od450nm值的对数为横坐标进行直线回归分析，r²值、rp值及斜率结果如下表4所示。

表4待检疫苗抗原含量与对应od450nm值线性回归分析比较

注：8个稀释点为原倍、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64和1:128。

可见，三次平行检测的两批待检疫苗样品均表现出良好的线性回归，r²均在0.99以上，rp值均大于1.0，斜率均在0.97以上，可以用于建立生物检定方法。

实施例7

本实施例对双平行线检测方法的可靠性检验。

根据上述实施例6中线性回归分析结果，取线性最好的6点进行分析，建立双平行线检定方法。按统计分析的基本要求，双平行线（6，6）检定方法应为直线回归非常显著（p＜0.01），偏离平行、二次曲线及反向二次曲线三个参数检验均应为不显著（p＞0.05）。本申请建立的6.6复孔检测法f（1，8）0.01＝12.31，f（1，8）0.05＝5.78，即当f＞12.31时，p＜0.01，非常显著；f＜5.78时，p＞0.05，不显著。满足以上条件时验证通过。

对本发明建立的效力试验待检疫苗样品（批号zyt-191和zyt-192）灭活疫苗进行两批待检样品三人次（a、b、c）检测，对本发明疫苗体外相对效力试验方法rp值及斜率值检测结果统计如表5，对本发明疫苗体外相对效力试验方法进行验证如表6，对同批次效力试rp值及斜率值分析如表7。

表5疫苗体外相对效力试验方法rp值及斜率值检测结果

表6疫苗体外相对效力试验方法进行验证

表7同批次疫苗体外相对效力试验rp值及斜率值分析

本发明疫苗体外相对效力试验进行了2批3人次检测均通过验证，其rp值及斜率值在6次检测结果中，同批次待检疫苗zyt-191rp值和斜率的变异系数（cv％）分别为1.38%和1.02%；待检疫苗zyt-192的rp值和斜率的变异系数（cv％）分别为3.67%和1.01%。变异系数（cv％）均小于10%，表明检测结果稳定重复性好。所有批次的rp值和斜率值最大分别为1.27和1.00，最小分别为110和0.97，平均值分别为1.20和0.99，标准差分别为6.3%和1.1%。

实施例8应用效果评价

用现有的方法检测批号为zyt-192-1、zyt-192-2、zyt-192-3、zyt-192-4、zyt-192-5的5批待检猪肺炎支原体灭活疫苗（dj166株）产品，同时与本发明动物体内相对效力试验结果进行应用比较（见表8）。

表8体外相对效力试验与动物体内疫苗相对效力相关性试验统计分析

从表8可以看出，5批待检疫苗产品的体外疫苗相对效力试验rp值及斜率值的标准差sd及变异系数cv值均明显低于动物体内疫苗相对效力试验，动物体内疫苗相对效力试验变异系数（cv%）为4.55%，远高于体外疫苗相对效力变异系数（cv%），表明本发明体外相对效力试验更稳定、重复性更好。

实施例9

将上述实验室制备的5批待检疫苗产品（zyt-192-1、zyt-192-2、zyt-192-3、zyt-192-4、zyt-192-5），置2-8℃保存初始、3、6、9、12、18和21个月，分别取样进行体外相对效力试验和动物体内疫苗相对效力试验，进行统计学分析及比较，结果如表9所示。

表9夹心elisa疫苗体外相对效力试验与动物体内疫苗相对效力试验结果比对分析

由上表9结果所示，以rp值≥1.0及斜率≥0.97为判定标准，将上述5批待检疫苗的6次取样间接竞争抑制elisa体外疫苗相对效力试验与动物体内疫苗相对效力试验同步进行检验，结果如下表9所示，体外疫苗相对效力试验rp值及斜率值的标准差sd及变异系数cv值均明显低于动物体内疫苗相对效力试验，且两种试验结果一致，5批待检疫苗的7次取样2种试验方法检验全部为合格品。相比于传统的动物体内疫苗相对效力试验每一个疫苗取样开始到检验结束需要2个月时间，夹心elisa体外疫苗相对效力试验方法只需6小时左右全部完成，具有高效且省事省力的优势。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。