一种犬孕酮免疫层析试纸条、制备方法及检测方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种犬孕酮免疫层析试纸条、制备方法及检测方法。

背景技术：

孕酮(英文progesterone，简称prog，中文亦称为黄体酮、孕甾酮、黄体甾酮、黄体激素、助孕激素、助孕素或助孕酮)是一种涉及雌性月经周期、妊娠和对人类或动物的胚胎有影响的类固醇，是最重要的孕激素。孕酮检查主要用于了解黄体的功能及卵巢有无排卵。犬孕酮在雌性犬生殖活动，如排卵、维持妊娠、启动分娩、乳腺发育等各方面发挥着重要的作用。临床检测犬孕酮可确定犬最佳配种期，通过监测孕酮值的下降，可确定分娩时间，也可确定妊娠期是否需要补充孕酮，提高受胎率，对提高犬繁殖能力和水平有重大意义，对犬生产养殖单位帮助巨大。犬孕酮在发情不同阶段，含量呈现规律性，临床检测方法有仪器法：化学发光仪器、液相色谱质谱联用仪和高效色谱等，这些仪器成本高，操作复杂，对检测人员及环境有较高的要求，需要配套试剂使用。

孕酮为类固醇类小分子物质，有抗原性无免疫原性，因此要获得高特异性孕酮抗体难度很大。在血液样本中通常存在很多与孕酮结构类似的类固醇类小分子物质，这些物质对孕酮的检测会形成干扰，同时小分子物质在检测过程中容易受空间位阻和基质效应的影响。在小分子类物质免疫层析检测中普遍存在灵敏度不高、线性范围窄、准确度不足的问题。基于免疫层析法检测，制备的胶体金检测试纸条能快速检测出结果，但是该方法的敏感性不足，且不能准确定量分析。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有检测犬孕酮的方法成本高或敏感性不足、不能准确定量分析的问题，旨在创新出一种反应快速，灵敏度高，成本低的犬孕酮检测试纸条，应用于宠物医院和犬生产繁殖单位使用，使得孕酮的检测快捷、准确和高效，从而指导生产实践。

为实现上述目的，本申请提供了一种犬孕酮免疫层析试纸条，所述试纸条包括底板，所述底板上从左到右依次搭接样品垫层、结合垫层、检测膜层和吸水垫层，所述结合垫层上包被有量子点标记的抗犬孕酮单克隆抗体，所述检测膜层上包被有犬孕酮抗原作为检测线，还包被有羊抗小鼠igg作为质控线。

作为本申请的进一步改进，所述结合垫层上包被的抗犬孕酮单克隆抗体的浓度为1.0mg/ml～1.5mg/ml；检测线上所述犬孕酮抗原的浓度为0.5mg/ml；质控线上所述羊抗小鼠igg的浓度为0.3mg/ml。

作为本申请的进一步改进，所述检测线与所述质控线之间的距离为1cm。

为实现上述目的，本申请提供了一种犬孕酮免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：s1、结合垫层的制备：首先，对聚酯纤维膜进行前处理；其次，应用量子点对抗犬孕酮单克隆抗体进行标记；最后，在经过前处理的所述聚酯纤维膜上包被量子点标记的抗犬孕酮单克隆抗体，得到结合垫层；s2、检测膜层的制备：在所述检测膜层上包被犬孕酮抗原作为检测线，包被羊抗小鼠igg作为质控线；s3、样品垫层的制备：将玻璃纤维膜在50mmol/l的tris-hcl溶液中浸泡后干燥，得到所述样品垫层。

作为本申请的进一步改进，所述聚酯纤维膜的前处理过程为将聚酯纤维膜在含1％bsa、1％蔗糖、0.1％tween-20的ph值8.4、0.01mol/l的tris-hcl的溶液中浸泡后干燥，备用。

作为本申请的进一步改进，量子点标记的抗犬孕酮单克隆抗体标记的过程如下：s1、量子点的活化：将100μl量子点、1mol/l的edc25ml以及1mol/l的nhs5ml充分混合均匀，得到混合溶液，将所述混合溶液置于4℃、10000r/min的条件下离心，弃去上清液，沉淀用ph值7.2的pbs缓冲液1ml重悬，重悬三次后将得到的所述量子点复溶在1ml的所述pbs缓冲液中，得到量子点缓冲溶液；s2、抗犬孕酮单克隆抗体的标记：将100μg的抗犬孕酮单克隆抗体逐滴加入到所述量子点缓冲溶液中，置于4℃下充分混合均匀，静置，得到量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体前驱体溶液，将所述的量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体前驱体溶液先应用1000r/min的转速离心后，弃去沉淀，取上清液，再将所述上清液应用10000r/min的转速离心，去掉上清液，将沉淀应用0.01mol/l的pbs缓冲液稀释至1ml，得到量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体，4℃保存备用。

作为本申请的进一步改进，所述量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体前溶液静置的时间为17h～24h。

作为本申请的进一步改进，所述量子点为亲水性量子点。

为实现上述目的，本申请还提供了一种应用前述所述的犬孕酮免疫层析试纸条检测犬孕酮的方法，s1、处理待检测样品：将待检测样品用pbs缓冲液稀释50倍，得到待检测样本；s2、检测过程：将待检测样本滴加到所述样品垫层上，静置，判定结果。

作为本申请的进一步改进，所述静置的时间为10min。

本发明的有益效果在于，本申请通过提供了一种犬孕酮免疫层析试纸条，所述试纸条包括底板，所述底板上从左到右依次搭接样品垫层、结合垫层、检测膜层和吸水垫层，所述结合垫层上包被有量子点标记的抗犬孕酮单克隆抗体，所述检测膜层上包被有犬孕酮抗原作为检测线，还包被有羊抗小鼠igg作为质控线。该试纸条能快速、准确的检测出血液样本中的犬孕酮，对临床检测具有重要意义，特别适合犬生产繁育单位使用，有较强的经济效益。

附图说明

图1为一种犬孕酮免疫层析试纸条的结构示意图；

图中：1、底板；2、样品垫层；3、结合垫层；4、检测膜层；5、吸水垫层；41、检测线；42、质控线。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，不用来限制本发明的范围。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

为了快捷、准确和高效的检测孕酮，从而指导生产实践，本申请提供了一种犬孕酮免疫层析试纸条，如图1所示，所述试纸条包括底板1，所述底板1上从左到右依次搭接样品垫层2、结合垫层3、检测膜层4和吸水垫层5，所述结合垫层3上包被有量子点标记的抗犬孕酮单克隆抗体，所述检测膜层4上包被有犬孕酮抗原作为检测线41，还包被有羊抗小鼠igg作为质控线42。

本申请中，作为优选的实施例，所述结合垫层3上包被的抗犬孕酮单克隆抗体的浓度为0.5mg/ml～3.5mg/ml，进一步优选为1.0mg/ml～1.5mg/ml；检测线41上所述犬孕酮抗原的浓度为0.3mg/ml～1.5mg/ml，进一步优选为0.5mg/ml；质控线42上所述羊抗小鼠igg的浓度为0.1mg/ml～1.0mg/ml，进一步优选为0.3mg/ml。作为优选的实施例，所述检测线41与所述质控线42之间的距离为1cm。

本申请中，还提供了一种犬孕酮免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：s1、结合垫层3的制备：首先，对聚酯纤维膜进行前处理；其次，应用量子点对抗犬孕酮单克隆抗体进行标记；最后，在经过前处理的所述聚酯纤维膜上包被量子点标记的抗犬孕酮单克隆抗体，得到结合垫层3；s2、检测膜层4的制备：在所述检测膜层4上包被犬孕酮抗原作为检测线41，包被羊抗小鼠igg作为质控线42；s3、样品垫层2的制备：将玻璃纤维膜在50mmol/l的tris-hcl溶液中浸泡后干燥，得到所述样品垫层2。

本申请中，作为优选的一个实施例，所述聚酯纤维膜的前处理过程为将聚酯纤维膜在含1％bsa(牛血清蛋白)、1％蔗糖、0.1％tween-20的ph值8.4、0.01mol/l的tris-hcl的溶液中浸泡后干燥，备用。本申请中，应用量子点对抗犬孕酮单克隆抗体进行标记的过程如下：s1、量子点的活化：将100μl量子点、1mol/l的edc25ml以及1mol/l的nhs5ml充分混合均匀，得到混合溶液，将所述混合溶液置于4℃、10000r/min的条件下离心，弃去上清液，沉淀用ph值7.2的pbs缓冲液1ml重悬，重悬三次后将得到的所述量子点复溶在1ml的所述pbs缓冲液中，得到量子点缓冲溶液；s2、抗犬孕酮单克隆抗体的标记：将100μg的抗犬孕酮单克隆抗体逐滴加入到所述量子点缓冲溶液中，置于4℃下充分混合均匀，静置，得到量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体前驱体溶液，将所述的量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体前驱体溶液先应用1000r/min的转速离心后，弃去沉淀，取上清液，再将所述上清液应用10000r/min的转速离心，去掉上清液，将沉淀应用0.01mol/l的pbs缓冲液稀释至1ml，得到量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体，4℃保存备用。作为优选的实施例，所述量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体前溶液静置的时间为17h～24h；所述量子点为亲水性量子点。本申请中所述的edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的简称，所述nhs为n-羟基琥珀酰亚胺的简称。

本申请中，作为一个优选的实施例，所述结合垫的材质为聚酯纤维膜，所述聚酯纤维膜的厚度设置为0.2mm左右，将其裁切成6mm宽的小条，亲水处理，具体过程为：将聚酯纤维膜在含1％bsa、1％蔗糖、0.1％tween-20的ph值8.4、0.01mol/l的tris-hcl的溶液中30min，取出后置于37℃烘箱干燥，备用，本发明中的聚酯纤维膜优选用上海金标公司产品，货号为vl98。

本申请中，量子点标记的抗犬孕酮单克隆抗体标记过程的一个优选的实施例如下：量子点标记抗体，包被。量子点标记抗体：本发明所用的量子点为亲水性羧基量子点，发射波长为620nm～640nm，所述的亲水性羧基量子点优选为上海鑫潼生物，货号为st630；抗体标记过程：所述的抗体优选为安提生物抗犬孕酮单克隆抗体，取100ul亲水性羧基量子点，加入1mol/l的edc25ml和1mol/l的nhs5ml，室温震荡30s充分混合均匀，对亲水性羧基量子点进行活化，活化后的亲水性羧基量子点溶液置于温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，沉淀用ph值为7.2的pbs缓冲液1ml重悬，反复操作三次，所得亲水性羧基量子点复溶在1ml的pbs缓冲液中，得到量子点缓冲溶液。将100ug的抗犬孕酮单克隆抗体逐滴缓慢加入上述量子点缓冲溶液中，于4℃温度下涡旋混合均匀，过夜，得到量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体前驱体溶液；先以1000r/min的离心速度对所述的量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体前驱体溶液进行离心，弃去沉淀，保留上清液，对上清液以10000r/min的转速离心30min，仔细吸取离心后的上清液，沉淀用0.01mol/l的pbs缓冲液稀释至1ml，标记完成，得到量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体，4℃温度下保存，备用。

本申请中，包被的过程为将标记好的抗体，均匀的喷在亲水处理过的结合垫上，室温干燥，密封保存。作为一个优选的实施例：所述量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体包被的过程为：使用喷金仪，将标记好的量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体均匀的喷洒在亲水处理过的结合垫上，室温干燥，密封保存。

本申请中，检测膜层4的制备：在所述检测膜层4上包被犬孕酮抗原作为检测线41，包被羊抗小鼠igg作为质控线42。所述检测膜层4为由硝酸纤维膜材质制备而成，制备过程中优选的一个实施例为：将所述硝酸纤维膜贴附在pvc背衬上面，使用喷金仪包被2条抗体线，一条为犬孕酮抗原，包被浓度分别为0.5mg/ml，另一条为羊抗小鼠igg，包被浓度为0.3mg/ml，所述犬孕酮抗原与所述羊抗小鼠igg之间的间隔距离为1cm，包被完成后，需要将包被好的硝酸纤维膜置于室温～37℃烘干，烘干完成后密封保存。所述喷金仪优选为划膜喷金仪；所述硝酸纤维膜孔径优选为10μm；所述pvc背衬厚度优选为2mm。所述划膜喷金仪进一步优选为上海金标公司的型号为xyz三维划膜喷金仪hm3035。

本申请中，样品垫层2的制备：将玻璃纤维膜在50mmol/l的tris-hcl溶液中浸泡后干燥，得到所述样品垫层2。作为优选的制备样品垫层2的一个实施例，所述样品垫层2的材质为玻璃纤维膜，厚度0.2mm左右，所述样品垫层2进一步优选为上海金标公司产品，货号为cb06，将其裁切成12mm宽的小条，亲水处理，亲水处理的具体过程为：将玻璃纤维膜浸泡在50mmol/l的tris-hcl溶液中30min，取出后置于37℃烘箱干燥，干燥后密封保存，备用。本申请中所述吸水垫层5优选为上海金标公司吸水纸，货号为sx18，将吸水纸优选为切割成30mm宽。

本申请中，按照上述的要求或实施例制备样品垫层2、结合垫层3、检测膜层4和吸水垫层5，制备完成后按照图1的顺序组装，使用斩切机纵切成3mm宽的试纸条，密封保存，所述密封保存的空间设置防潮干燥剂。所述斩切机优选为上海金标公司的产品，型号为zq3500。进一步的，与所述试纸条配套使用的附件还包括：样本稀释液、无菌棉签。所述样本稀释液和所述无菌棉签两者皆为商业试剂，优选为康华生物产品；所述样本稀释液和所述无菌棉签也可替换为同类型产品。

本申请中，还提供了一种应用前面所述的犬孕酮免疫层析试纸条检测犬孕酮的方法，s1、处理待检测样品：将待检测样品用pbs缓冲液稀释50倍，得到待检测样本；s2、检测过程：将待检测样本滴加到所述样品垫层2上，静置，所述静置的时间为10min，判定结果。本申请还提供了一种优选的样品检测的实施例：检测时，将犬血清或者血浆用pbs稀释50倍后滴加在样品垫层2上，血清或血浆中的犬孕酮会随着稀释液在试纸条上层析流动，在结合垫层3上结合了量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体后，流动至检测膜层4的检测线41上，与检测线41上犬孕酮抗原结合后，阳性样本会呈现出紫外线下的红色线条，不同含量孕酮的样本显色深度不同，可通过量子点读数仪确认孕酮含量，从而进行后续生产实践。检测时，血样中的孕酮含量与颜色深度呈线性正相关，该试纸条在10分钟内完成检测，获取结果准确，对进一步结果分析提供依据。

为了检测本试纸条的性能，分别做如下检测：

敏感性：将犬孕酮含量80ng/ml的标准品做2倍梯度稀释，与化学发光方法比对，结果如表一所示：

表一：试纸条敏感性测试结果比对

结果显示，本试纸条可以检测出低至0.625ug/ml含量的犬血样本。

特异性：随机选择100份临床犬血清样本用试纸条和化学发光方法做检测，所得孕酮含量范围样本数量如表二所示：

表二：不同孕酮含量的犬血清样本分析结果

结果显示，本试纸条与化学发光法检测结果符合率100％。

稳定性：将试纸条在37℃培养箱内，分别放置7d，14d，28d后取出检测敏感性，结果与未作破坏性实验数据一致。

综上所述，本申请通过提供了一种犬孕酮免疫层析试纸条，所述试纸条包括底板1，所述底板1上从左到右依次搭接样品垫层2、结合垫层3、检测膜层4和吸水垫层5，所述结合垫层3上包被有量子点标记的抗犬孕酮单克隆抗体，所述检测膜层4上包被有犬孕酮抗原作为检测线41，还包被有羊抗小鼠igg作为质控线42。本发明的优点在于检测犬孕酮快速、准确，低成本，对临床检测有重要意义，可推广性高，市场应用前景广阔，整个检测过程在10min内完成，通过读数仪，可知犬血液中的孕酮含量。

本发明的关键技术是量子点标记抗犬孕酮单克隆抗体以及包被试纸条，拟保护的重点在量子点和抗体选择，本申请中选用的抗犬孕酮单克隆抗体，有利于标记，质量稳定；应用本申请设计的标记条件，有利于提升犬孕酮检测的敏感性和特异性，与化学发光法一致；本申请中采用的包被浓度，既有利于提升犬孕酮检测的敏感性和特异性，又能很好的控制成本；本申请所设计的试纸条需要借助简单小型量子点读数仪使用，所述量子点读数仪内设孕酮含量参数比对表，测试完成的孕酮含量可以直接对生产繁育提出建议，便于养殖单位基层人员使用。此外，本发明还可减少elisa实验过程中医疗废弃物(固废和液废)的产生，对环保作用明显，有较强的经济效益，特别适合犬生产繁育单位使用，成本低，检测实惠，可大量推广。

需要强调的是：以上仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。