一种罗丹明B胶体金检测试纸条及其制备方法和应用

本发明属于食品安全检测领域，具体是涉及罗丹明b胶体金检测试纸条及其制备方法和应用。

背景技术：

罗丹明b（rhodamineb）俗名叫玫瑰精、花粉红，也叫玫瑰红b，是一种鲜桃红色、三苯甲烷类的碱性人工染料，是人工合成的化学物质，主要用于造纸工业、皮毛制品、纤维制品、陶瓷制品等染色，也用于制造油漆等颜料。因其价格便宜、着色强、稳定性强，已逐渐被不法商贩用做替代食品染料的着色剂。近年来有关部门查出大量的玫瑰精用到食品当中的情况，从火腿、香肠、腊肉等肉产品到辣椒油、果酱等调味品及各种五颜六色的饮料。该染料具有高毒、高残留及“三致”(致畸、致癌、致突变)等副作用。相关资料显示，经过小鼠试验发现，该物质可以透过皮肤，引起皮下组织肉瘤，不同程度地食入、吸入或皮肤接触会引起头痛、头晕、恶心、呕吐、腹痛、四肢酸痛、乏力等不良症状。由于工业染料严令禁止使用到食品加工中，所以国家的检测机构在检验食品时，不会对这些工业染料进行检测。由于它并非法定食品添加剂，所以没有制定安全摄入量，监督部门也不可能对法定范围以外的成千上百种工业原料进行常规抽查。这就让很多黑心老板添加工业染料暂时没有了后顾之忧。目前我国和欧盟等已禁止罗丹明b在食品中使用，但国内还没有检验食品中罗丹明b的国家标准及行业标准，也没有快速检测与鉴定方法。传统的仪器方法有液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、电化学方法、薄层色谱法等，但这些方法操作繁琐，且对操作者素质要求较高，不适宜现场高通量的样品检测。因此，这些方法在使用中受到很大的限制，而金标免疫层析法(goldimmunochromatographicassay,gica)因其快速、操作简便、试剂稳定、可室温储运的特点在近年来得到越来越多的应用。它是一种建立在免疫层析技术、单克隆抗体技术和胶体金标记技术基础上的一种固相检测技术，使用时只需把胶体金试纸条下端插入样品溶液，几分钟就可以判断结果。该法使用方便，不需要特殊的仪器设备，便于基层使用和现场使用；且由于为干试纸条形式，标记物稳定，在4℃贮存两年以上，无信号衰减现象，但目前关于食品中罗丹明b的检测未见有胶体金检测试纸条。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种罗丹明b胶体金检测试纸条及其制备方法和应用，能够快速有效检测食品中罗丹明b染色剂。

一种胶体金试纸条，有一底衬、该底衬上面的中部粘贴一包被膜，该包被膜中部有一条包被罗丹明b检测抗原的检测线和一条包被羊抗鼠igg抗体的控制线，包被膜的上面左右分别粘贴一涂覆金标单克隆抗体的玻璃纤维膜和吸水纸；涂覆金标单克隆抗体的玻璃纤维膜上面粘贴一样品垫。

上述胶体金试纸条的制备方法，其特征在于先制备包被膜，将用包被缓冲液稀释的罗丹明b检测抗原和羊抗鼠igg抗体稀释，并将二者分别喷于硝酸纤维膜中部上，分别形成检测线和质控线，再制备涂覆金标单克隆抗体的玻璃纤维膜，然后将包被摸粘贴在底衬上，在包被摸的上面左右分别粘贴一涂覆金标单克隆抗体的玻璃纤维膜和吸水纸；涂覆金标单克隆抗体的玻璃纤维膜上面粘贴一样品垫，做成大板，切割即得胶体金试纸条。

上述胶体金试纸条在检测罗丹明b染色剂中的应用。

本发明利用现代国际最先进的胶体金免疫层析技术，提供一种农贸市场、食品生产基地、基层自测等用的检测罗丹明b染色剂的胶体金试纸条，该试纸条具有特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点，且不需使用仪器设备，成本低廉，操作简便，能广泛应用于农贸市场、食品生产基地、基层及个人对于罗丹明b染色剂的检测和食品监管部门对于罗丹明b染色剂的现场检测和筛查。

附图说明

图1为本发明试纸条的纵剖结构示意图。

具体实施方式

罗丹明b胶体金检测试纸条的制备：罗丹明b染色剂的单克隆抗体细胞株的制备和鉴定：

抗原合成：

采用活性酯法罗丹明b与载体蛋白按摩尔比20∶1进行反应，称取96mg罗丹明b，溶于2ml的去离子水中，加入25mgnhs和39mgedc，室温搅拌反应过夜。离心取上清，将此上清缓慢滴加到bsa溶液中(680mgbsa溶于15mlpbs中)，4℃搅拌反应过夜。反应结束后，离心去上清，取上清装入透析袋中，用pbs透析3d(4℃)，1d换2次透析液，小管分装冷藏备用。同理合成罗丹明b-ova检测抗原。

动物免疫：

用罗丹明b-bsa免疫6周龄balb/c雌性小鼠10只，免疫剂量为每只50μg/0.1ml，腹腔注射。2次基础免疫，多次加强免疫，免疫前采尾静脉血用作空白阴性对照。第1次注射将抗原与等量弗氏完全佐剂混合乳化后注射，间隔4周后，进行第2次基础免疫，第2次基础免疫用弗氏不完全佐剂乳化。以后每隔2周进行1次加强免疫，加强免疫不用佐剂，直接腹腔注射抗原。融合前3d，进行1次加强免疫。

杂交瘤细胞制备技术：

脾细胞的制备：1、引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；2、无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗1次；3、把脾脏置于装有15ml无血清培养液的培养平皿中用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次，获取细胞，制成细胞悬液；4、把细胞悬液注入50ml离心管中，加10~20ml培养液，轻轻吹打数次，室温中置5min；5、离心(1200r/min)计数、备用。

骨髓瘤细胞的准备：选取对数生长期的骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90%)。

细胞融合：1、按1∶10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。2、将1ml40%的peg液1滴滴加入细胞团中，在60s内加完，同时不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管；3、在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60s内加完；4、于5min内慢慢加完20ml无血清培养液；5、离心(1000r/min，8min)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；6、取96孔板，每孔加50μl；7、置于37℃、5%co2培养箱中培养，24h后更换成hat选择性培养液。

筛选方法

间接elisa(ielisa)：酶标板每孔加一定浓度的用包被液稀释的包被抗原100μl，4℃包被过夜后，用洗涤液洗板3次(下同)，每孔加入封闭液200μl，于37°c温箱中放置1h，取出洗涤后，每孔再加入稀释的抗体100μl，再在37℃温箱中反应30min，洗涤后，加入羊抗鼠igg-hrp溶液100μl，37°c温箱中反应30min。洗涤后加入底物液100μl，37℃温箱中避光显色15min，最后加2mol/lh2so450μl终止反应，于酶标仪读取a450nm值。间接竞争elisa(icelisa)的程序与间接elisa程序大部分相同，不同之处在于用封闭液封闭，洗酶标板之后，加入稀释的罗丹明b标准液50μl（按0、1、3、9、27、81μg/l稀释成5个浓度梯度)，再加入稀释的抗体50μl，其余的步骤相同。

抗罗丹明bmab细胞株的建立及腹水制备

通过杂交瘤技术，将融合细胞铺在10块96孔细胞培养板上。10d后，通过间接elisa筛选融合细胞。间接elisa筛选出的强阳性孔(a值>1)，再通过间接竞争elisa从强阳性孔中筛选出对罗丹明b有很好抑制反应的孔(100μg/l的罗丹明b能抑制零标准孔的a值的50%以上)。将此孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆(一般亚克隆3~4次直至阳性率达到100%)以达到纯化细胞的目的。将纯化后的细胞腹腔注射到用石蜡油预处理过的小鼠腹腔中制备腹水mab，每只老鼠注射1×106个杂交瘤细胞。收集到腹水抗体后通过辛酸-硫酸铵纯化。

包被膜4的制备：

包被膜缓冲液的制备：将0.05m、ph9.6的碳酸盐缓冲液（pbs），用0.22u膜过滤，置4℃备用，有效期七天。

封闭缓冲液的制备：将0.01m、ph7.0的pbs，用0.02μm膜过滤，置4℃备用，有效期七天。

配置封闭工作液：将含2%bsa、2%脱脂奶、0.01m、ph7.0的pbs，用0.22μm膜过滤，置4℃备用，有效期3天。

检测线6制备：调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包被缓冲液稀释罗丹明b染色剂检测抗原，浓度为70μg/ml，在硝酸纤维膜中部上划线，室温晾干20分钟。

质控线7制备：调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包被缓冲液稀释羊抗鼠igg抗体，浓度为2mg/ml，在硝酸纤维膜上划线，该线与检测线平行，两线间隔5mm，应细致均匀，室温晾干20分钟。该两线用的液体分别渗入硝酸纤维膜中，即分别为检测线6和质控线7。

包被膜4制备：用上述封闭工作液将含有检测线6和控制线7的硝酸纤维膜37℃封闭60分钟，取出后置37℃烘干处理两小时，封袋备用。

涂覆金标单克隆抗体的玻璃纤维膜3的制造

氯金酸的配制：将10g氯金酸用1000ml双蒸水溶解配成1%溶液，置4℃备用，有效期3天。

柠檬酸三钠的配置：用双蒸水溶解柠檬酸三钠，配成1%溶液，置4℃备用，有效期3天。

0.1m碳酸钾的配制：将13.8g碳酸钾用1000ml双蒸水配制成0.1m碳酸钾溶液，0.22u膜滤过，置4℃备用，有效期7天。

标记洗涤液的配制：将20gbsa用1000ml0.01m、ph7.0pbs配制成2%bsa溶液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期15天。

金标单克隆抗体保存液的配置：将10gbsa、5g脱脂奶粉、0.5gnan3和1mltween-20在1000ml0.01m、ph7.0pbs中溶解，用0.22u膜过滤，置4℃备用，有效期15天。

胶体金的烧制：用双蒸水将1%氯金酸稀释成0.01%，置电炉煮沸，按每100毫升0.01%氯金酸加入4毫升1%柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物。

金标单克隆抗体的制备：用0.1m碳酸钾调胶体金ph值至7.6，按10微克单克隆抗体/毫升胶体金加入抗罗丹明b染色剂单克隆抗体，混匀，静置30分钟，12000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标单克隆抗体保存液溶解，置4℃备用，有效期7天。

将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺10平方厘米，干燥，封袋，置4℃备用。

胶体金试纸条的制作

所述底衬1、样品垫2和吸水纸5是本领域通用的材料。将上述包被膜4、涂覆金标单克隆抗体的玻璃纤维膜3、底衬1、样品垫2和吸水纸5依次粘贴起来，得到试纸板，最后将该试纸板切割成不同宽度的试纸条即可。

上述的胶体金试纸条在检测罗丹明b染色剂中的应用

用本胶体金试纸条检测食物样品中的罗丹明b染色剂时，如果检测食品样品中含有罗丹明b染色剂，将该样品提取液滴加在本试纸条的样品垫2上，该液体随后沿着试纸条进入该试纸条上涂覆金标单克隆抗体的玻璃纤维膜3中时，食物样品中含有的罗丹明b染色剂与本试纸条上涂覆金标单克隆抗体的玻璃纤维膜3中的罗丹明b单克隆抗体形成相应的复合物，由于涂覆金标单克隆抗体已经结合了相应的抗原，故前行并不与包被膜4上的罗丹明b检测抗原进行结合，不形成色带，即不在检测线6处形成色带，继续前行与包被膜4中的羊抗鼠igg抗体形成红色色带，即在质控线7处形成红色色带。如果质控线7不出现红色色带，则说明该试纸条失效。如果检测食物样品中不含有罗丹明b染色剂，则前行的金标单克隆抗体与包被膜4上的罗丹明b检测抗原结合成相应的复合物形成红色色带，即在检测线6处形成红色色带，而质控线7处必定仍出现红色色带；如果质控线7不出现红色色带，则说明该试纸条失效。

本试纸条可以检测蔬菜、水果、辣椒油、肉类等食品，将食品中的液体/提取液离心后，将所得的液体滴加在本试纸条的样品垫2上，出现的结果和上述过程相同。