专利名称：分离、鉴定和/或分析全血样品中的白细胞种群的方法和试剂系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速进行全血中的红细胞部分的溶血作用的新溶解剂系统，借助此种系统可将白细胞部分以其天然状态或接近天然状态的形式分离出来。然后可将该白细胞部分在多种不同的环境中进行进一步研究或分析。本发明的溶解剂实际上由一种水溶性化合物组成，此种水溶性化合物在水介质中至少部分离解，从而释放出质子和平衡离子。在将相应浓度的此种化合物加入全血样品中时，其离解的程度可有效地将血样酸化(PH值约在2.6至4.0范围内)，并同时将血样的重量克分子渗透压浓度保持在低于大约100毫渗克分子。本溶解剂系统的优选用途之一是预处理全血样品，来进行红细胞部分的快速和实际上是完全的溶血作用。此种预处理还导致微妙地改变白细胞部分，从而，使白细胞部分进一步分离为至少五种独特的亚种群，因此，本试剂系统适用于配制用聚焦流式分析系统，例如VCS全血分析仪和EpicsModelC和PROFILE流式细胞光度计(均由美国佛罗里达州海厄利亚conlter电子仪器有限公司出售)，进行分析的全血样品。
在研究和分析复合生物流体(即全血)的组分之前，通常需要将其分离成为其各种组分，这也往往是在此种研究和分析中所采用的许多确认的分析方案和/或测试仪器的必要的技术要求。在血样中的流体部分的此种研究或分析是最使人关注的场合，可将细胞部分从血样中分离出去，而不必考虑细胞膜的生存或细胞膜的完整性。相反，在血样中的细胞部分的此种研究或分析是最使研究人员或临床医生关注的场合时，将全血样品分离成为各种细胞组分，就需要相应地调节血样的处理/加工技术。将全血样品分离成为其各种细胞组分的常规方法是用离心的方法。虽然此种方法是有效的，但是需要花很大的劳动、效率相当低而且需要用人工来控制血样中的细胞部分。
在试图用化学药剂来进行血样中的细胞部分的此种分离时，由于种种原因，结果始终是不能令人完全满意的。更准确地说，细胞种群在活体内或体外的生活强度和生存性，均取决于保持一种与保存实际细胞结构和细胞中的化学平衡一致的准确生理环境。细胞膜的渗透性和运送特性可控制细胞中的化学平衡。生理环境的改变又可以诱发细胞膜的应答或改变。细胞膜应答在性质上是“防御性的”;也就是说，细胞膜的生理应答是适合于保持细胞中的化学平衡，因此是延续和不间断细胞的生存性。
现在已充分认识到，细胞只能在一定的限度范围内耐受此种理想生理环境的改变;而且，还认识到如果超过此种限度，细胞就会遭到永久性的损伤。在本技术领域中还进一步认识到，此种生理环境的改变(即，稀释介质的毒性-即使是用蒸馏水)可影响细胞的溶血作用。
已经广泛地研究了全血中的各种细胞种群对其生理环境的改变的耐受程度并利用了大量的文献资料来证明。改变全血中的细胞部分的生理环境的各个方面的效果是微妙的和引人注目的，而且可以通过饮食代谢物和/或异物来实现。这些研究工作包括Dacosta等人在Transfusion杂志，13，305(1973年)中所发表的检测细胞制剂对不同药物的反应;Kobayoashi.T等人在JournalofBioChemistry，93，675(1983年)中所发表的检测细胞制剂对欲食不平衡的反应;和Rother.T等人在Z.ImmunologieForschungsgemeinschaft，155，118(1978年)中和Schettini.F等人在ActaPaediat.scand.，60，17(1971年)中所发表的检测细胞制剂对改变PH值的反应。
在上述每一篇文章中，药物、食物代谢物或改变PH值均显著地将血液的生理环境改变到可使红白细胞发生溶血作用的程度。
更准确地说，上述Rother等人的文章，报导了可通过应用在有EDTA存在的情况下可溶解未致敏的红血细胞的盐酸来酸化(PH值为6.4)从而使血清活化。这篇文章将上述这种酸化作用的效果与用腠岛素使血清活化后所观察到的“偏差溶解”活性进行了比较。SChettini和他的同事们进行了一项独立的、与Rother等人的研究没有联系的研究工作，他们得出结论认为，婴儿和年纪较小的儿童的红细胞对酸的溶血作用比年纪较大的儿童更敏感。
到目前为止，还没有一种化学处理能快速地和有效地将全血样品分离为活的细胞部分。在应用全血样品的一种或几件化学处理的时候(就像在配制或预处理全血来进行的白细胞的分离时)，此种化学处理的焦点是根据分离/分析(ⅰ)在此种化学处理后所剩下来的细胞碎片(即核);(ⅱ)由这些化学处理所固定的细胞;或(ⅲ)这些细胞的比较苛刻的改变(这些改变终于导致细胞的最后的分离)来改变血样而使其细胞组分互相分离。但是，全血样品的这些比较苛刻的和分裂性的化学处理已成功地应用于与比较复杂的测试仪器相结合的情况下。更准确地说，改变细胞种群在体外的生理环境，已有利地用来测定某些细胞参数和用来测定个别种群的数量。在鉴定全血的细胞的个别的细胞亚种群中，每一种个别的细胞种群对其生理环境的改变的独特的反应是具有特殊的优点的。以前已将血液的白细胞分类为二种主要的部分淋巴样部分和髓样部分。淋巴样部分包括淋巴细胞(B和T细胞)。髓样部分包括单核白细胞和粒性白细胞(嗜中性白细胞、嗜碱性白细胞和嗜酸性白细胞)。改变全血的细胞种群的生理环境的一种可接受的技术是通过在血样品中加入一种所谓的“溶解剂”。某些溶解剂和溶解剂系统的发展已使临床医生具有有效地将全血中的白细胞种群与红细胞种群分离的能力。在血样中的细胞种群的相对浓度和这些细胞中的某些分类的粗形态外观在临床上是具有重要意义的。
因此，进一步分离白细胞种群的能力，对研究和处理各种疾病，提供了一种非常宝贵的诊断手段。还进一步认识到，可鉴定白细胞亚种群的数目越大，对任何一种此类亚种群的鉴定就越准确和越可靠。
在最近的专利文献中，发表了许多公开各种可提高进行白细胞分离的自动测试仪器的能力的试剂系统和技术的参考资料。下列参考资料是本技术领域中的有代表性的有关专利文献美国专利第3，874，852号;第4，286，963号;第4，346，018号;第4，485，175;第4，520，274号;第4，529，740号和美国专利申请序列第615，961号(相当于1985年12月19日公布的国际申请PCT/US85/00954号)和第615，966号(相当于1985年12月19日公布的国际专利申请PCT/US85/00868号)，本发明详细地参考了所有上述文献。
美国专利第3，874，852号(Hamill)叙述了在测定全血的白细胞和血红蛋白中所应用的试剂系统和方法。此种试剂系统包括一种季胺盐和氰离子实际上是无亚铁氰化物的水溶液。此种试剂系统对于全血中的红血细胞和血小板细胞的基质溶解和将游离血红蛋白转化为色原都是有效的。有人报道了此种系统可具有诊断准确性地用于测定白细胞和血红蛋白。但是，应用此系统所提供的白细胞种群的分布，仅限于总的细胞的计数，而不能进一步将此种细胞部分分离为其分离的亚种群。
美国专利第4，286，963号(Ledis等人)叙述了将全血中的红血细胞进行快速分离的溶解稀释剂和方法。此种稀释剂提高了进行白细胞种群的淋巴样亚种群和髓样亚种群的分类鉴定的自动测试仪器的能力。Ledis所叙述的溶解稀释剂是由至少一种季胺盐和一种芳基取代的短链烷醇在缓冲水介质(PH值为3.5至5.0)中的混合物所组成。但是，此种Ledis专利的溶解稀释剂，仅限于其所具有的将白细胞种群分离为二种主要的亚种群的能力;也就是，分离为淋巴样部分和髓样部分的能力。
美国专利第4，346，018号(Carter等人)叙述了一种多用途血液稀释剂和应用此种稀释剂与一种弱溶解剂相结合的方法来进行血红蛋白测定和将淋巴细胞种群分离为淋巴样亚种群和髓样亚种群。此种稀释剂包括N-(2-乙酰氨荃)亚氨基二乙酸、(ADA)，与其它组合一起作为一种血液稳定剂。该溶解剂包括至少一种季按盐的水溶液。但是，此种Carter专利的稀释剂/溶解剂仅限于其所具有的将白细胞种群分离为二种主要的亚种群的能力;也就是，分离为淋巴样部分和髓样部分的能力。此外，已经发现ADA有助于稳定红血细胞种群和血小板种群的大小分布、细胞形状，而最主要的是，将红血细胞种群和血小板种群的高度的细胞分散体稳定到超过以前用其他化合物所稳定的程度。
美国专利第4，485，175号(Ledis等人)叙述了一种试剂系统和应用自动细胞计数设备将白细胞种群分离定为三种亚种群的方法。此试剂系统包括一种血液稀释剂和一种溶解剂。在将此种溶解剂(包括一种季胺盐的水溶液)，在适度的浓度条件和比较低的速度下，加入稀释血样中时，可对各种白细胞亚种群造成意想不到的体积改变。此种可使Ledis等人达到白细胞种群的分离度的发现，是以观察到粒性白细胞亚种群对溶解剂的比较高的灵敏度为基础的。控制淋巴细胞种群与溶解剂接触的速度，可较好地保留粒性白细胞亚种群。但是，此种Ledis等人专利的试剂系统，仅限于其所具有的将白细胞种群分离为三种亚种群的能力;也就是，分离为淋巴白细胞亚种群、单核白细胞亚种群和粒性白细胞亚种群的能力。虽然所有上述溶解剂和试剂系统均促进分离血样的白细胞部分(在较大或较小的程度上)，但是每一种溶解剂和试剂系统均具有一种共同的缺陷;也就是说，不能在没有不利地改变进行此种处理的细胞的化学平衡的情况下，来分离血样的白细胞部分。在诱发此种化学平衡的改变时，对细胞种群的影响就可以从比较小的改变(即，膨胀)一至到溶解。对白细胞种群的生理环境的显著改变，还会改变白细胞表面标记的免疫化学应答。因此，用此种惯用的溶解剂系统处理白细胞种群，与这些白细胞种群的进一步免疫化学研究是根本不相容的。因此，到目前为止，根据上述每一种细胞种群的各自的表面标记的免疫化学应答的差异，此种局限性，妨碍了单独应用溶解剂或与其他仪器配合使用，来进一步改进各种疾病状态的诊断过程。
因此，本发明的目的是补救现有技术中的上述以及有关的缺陷。
更准确地说，本发明的主要目的是对复合生物流体样品，例如全血，提供一种化学处理或预处理，此种化学处理促进后续分离、鉴定和/或分析在该流体样品中存在的一种或几种细胞种群。
本发明的另一个目的是，对全血样品提供一种化学处理或预处理，此种化学处理促进血样的分离并从而促进以其天然状态或接近天然状态形式存在的的白细胞部分的物理、生理和/免疫化学性质为基础的白细胞部分的分离、鉴定和/或分析。
本发明的另一个目的是，提供一种全血样品的化学处理或预处理，此种处理方法是选择性地只适用于血样中的一种细胞成分。
本发明的另一个目的是，提供一种试剂系统，此种试剂系统可快速速地和有效地将全血样品分离为实际上是完整的白细胞部分和溶解的红细胞部分。
本发明的再一个目的是，提供一种溶解剂系统，可用来分离鉴定全血中的白细胞亚种群。
本发明的再一个目的是，提供一种包括一种溶解剂和一种伴抑制剂的新溶解系统，可用来分离鉴定全血中的白细胞亚种群。
本发明的再一个目的是，提供一种新溶解剂系统，此溶解剂系统可通过(a)测定此种白细胞亚种群的物理和/或光学性质，和/或(b)观察此种白细胞亚种群与专门吸附每一种白细胞亚种群上的一种或几种表面标记的免疫剂(即，抗血清)的免疫化学应答或互相作用，有效地用来分离鉴定全血中的白细胞亚种群。
本发明的进一步目的是，提供一种方法，此种方法可通过(a)测定白细胞亚种群的物理和/或光学性质，(b)此种白细胞亚种群对专门吸附每一种所述白细胞亚种群上的一种或几种表面标记的抗血清的免疫化学应答，来进行白细胞亚种群的分离鉴定。
上述和有关目的，可通过提供一种可选择性地与一种复合生物流体样品的各种细胞组分互相作用的化学试剂系统来实现。此种试剂系统，可在其各种预期的应用环境中，提供至少一种试剂组分来选择性地将复合生物流体样品的一种或几种细胞成分，有效地改变到可进行所研究的细胞成分的后续分离、鉴定和/或分析所必须的程度。此种试剂系统，通过提供一种单独的用来抑制或阻滞细胞改变剂对血样中的细胞种群的作用的试剂，还进一步预期具有调整血样中的细胞成分的化学处理的能力。
本发明的原理和概念已成功地在进行白血细胞的分类分析之前用于处理全血样品。本发明的化学试剂系统的基本组分，包括一种“溶解剂”和一种称为“抑制剂”的溶解剂的伴剂。抑制剂的主要功能是阻滞溶解剂的活性和血样在用溶解剂处理后恢复血样的离子平衡。
因此，本发明的溶解剂系统和方法，具有以上概述的目的，即全血样的红血细胞种群的选择性溶血作用，并同时促进以显示所研究的白细胞亚种群的特征的一种或几种物理、生理和/或免疫化学特性为基础的一种或几种白细胞亚种群的后续分离、鉴定和/或分析。本发明的溶解剂实际上是由一种水溶性化合物组成的，此种水溶性化合物在水介质中至少部分离解，从而释放出质子和平衡离子。在将相应浓度的此种化合物加入全血样品中时，此种化合物的离解程度可有效地将血样酸化(PH值在大约2.6至4.0的范围内)，并同时将血样的重量克分子渗透压浓度保持在低于大约100毫渗克分子。已经发现至少有三类化合物适合作为实施本发现的目的溶解剂。这几类化合物包括低分子量的羧酸、磺酸和活性苯酚。
适合作为本发明的溶解剂的羧酸，可用下列通式表示R-COOH式中R是H、一种1至3个碳原子的脂肪烃基;一种羰基取代的1至3个碳原子的脂肪烃基;一种羟基取代的1至3个碳原子的脂肪烃基;或一种1至3个碳原子的脂肪烃基和多羰基和/或羟基取代基。
在上述通式范围内的有代表性的羧酸，包括甲酸、甲基-羧酸(乙酸)、2-羟基-乙基-2-羧酸(乳酸);1，2-乙基-1二羧酸(琥珀酸);和2-羟基-1，2，3-丙基-三羧酸(柠檬酸);及其混合物。
适合作为本发明的溶解剂的磺酸，可用下列通式表示R-SO3H式中R是羟基、一种1至3个碳原子的脂肪烃基或芳基。
在上述通式范围内的有代表性的磺酸，包括硫酸;甲磺酸;乙磺酸;苯磺酸;对甲苯磺酸;硝基苯磺酸及其混合物。
适合作为本发明的溶解剂的活性苯酚，可用下列通式表示
式中R是一种吸电子基团，例如囟基、氰基、硝基或任何上述吸电子取代基的组合基团;和n是1-3。
在上述通式范围内的有代表性的活性苯酚，包括对硝基苯酚;间硝苯酚;邻硝基苯酚;2，4-二硝基苯酚;对氯苯酚;对氰基苯酚;和1-氯-2，4-二硝基苯酚;及其混合物。
以上是可用做符合本发明的目的的溶解剂的有代表性的几类物质。可以理解，在血样中比较弱的酸将以未离解的化合物和离解状态的化合物这二种形式存在。当然，强酸在血样中实际上是完全离解的。某些未离解的酸和由离解的酸离解出来的平衡离子均可明显地影响白细胞部分的分离度，而具体影响的程度则取决于它们在血样中的相对浓度和所研究的细胞被分析物对酸和/或其平衡离子的生理识别(如果有的话)。例如，磷酸，即使在适当的PH值下，通常是不能令人满意地将白细胞分离为5种亚种群。一般是假设平衡离子(磷酸根离子)的相容性是不合乎要求的，因此，要将白细胞种群分离显然是很困难的。
在本发明的概念的此种优选是实施方案中，新溶解剂系统包括一种水溶液，此溶液中含有一种分离有效量的选自甲酸、乙酸及其混合物的溶解剂。在这些混合物中，甲酸最好是构成主要的功能组分而乙酸则仅以少量的形式存在。在本公开中所应用的“分离有效量”一词的含义是，表示溶解剂的浓度不仅对溶解红血细胞是有效的，而且还可以进行白细胞部分的微妙改变，来促进此种白细胞部分的后续分离、鉴定和/或分析;其中还包括提高进行白细胞种群的至少5种亚种种群的分类分析和鉴定的测试仪器的能力。甲酸在溶解剂中的优选浓度范围是在大约0.10至0.15%(体积/体积)的范围内。已经测出满足上述规范的此种优选溶解剂的浓度为每毫升全血需要大约0.009至0.020毫升的甲酸。此种，溶解剂可实现白细胞部分的此种微妙的改变，并同时保持白细胞种群的5种细胞亚种群中的每一种亚种群的表面标记的免疫化学应答。如上所述，在用该溶解剂进行全血样品的此种处理的主要目的是，此种试剂有效地实现了红血细胞部分的基质溶解作用，并同时将白细胞部分保持在其实际上是天然的状态。
在本发明的一种优选实施方案中，试剂系统除含有溶解剂外，还含有皂苷。“皂苷”一词是指商品级皂树皂苷粉。将皂苷加入试剂系统是随意的，通常只是在临床医生不是用光学照相或免疫化学技术来监测某些白细胞亚种群参数时才加入。在溶解剂系统中加入适量的皂苷是有效的，因为它具有降低红细胞碎片的大小的能力，从而防止了它们在通过测量电不透明度和/或应用Coulter在美国专利第2，656，508号和3，502，974号(本文均详细地参了这些文献)中所叙述的方法，测量Coulter体积来测定某些白细胞参数时所发生的干扰。已经测出对于降低红细胞碎片的大小是有效的优选皂苷浓度范围为每毫升全血需要大约.006至0.012克。简单地说，该技术涉及应用射频电流(RF)和直流(DC)电场激励来测定细胞的体积。通过应用低频或直流(DC)和射频(RF)电流激励，产生一种检测粒子的电场，于是从一个单独的粒子(即白细胞)通过电场时得到二种或几种互相关联的输出信号。从此种输出信号所得出的数值叫做“相对不透明度”(relativeOpacity)，此种相对不透明度对于每一种白细胞的亚种群是独有的。在溶解剂中加入皂苷，可将红血细胞碎片的大小降低到它们不会干扰或它们本身不会导致显示一种白细胞种群特征的输出信号发生偏差的程度。
在细胞分类是以光散射测量为基础的情况下(应用Fulwyler在美国专利第3，989，381号和/或Auer等人在美国专利第4，038，556号中所叙述的技术一本文均详细地参考了这些文献)，红细胞碎片不会干扰或不利地影响白细胞种群的各种亚种群的光度分类。因此，在白细胞种群的亚种群分类是以光度分析为基础的情况下，就不需要在溶解剂系统中加入皂苷。
对于本发明的分类方法来说，血液样品与溶解剂系统接触的时间的长短是具有关键性意义的。正如在下文公开的实例中所说明的，此种接触时间不应超过10秒钟，而最好是只需要大约6秒钟或少于6秒钟。这二种接触时间都是指在室温的条件下(约18至28℃)。在每一种情况中，都是通过简单地在血样中加入适当浓度的盐类来抑制溶解剂的作用，使细胞回到其天然的生理环境。抑制剂有效地阻滞溶解剂对白细胞种群的进一步活性，而不需要再加入固定剂。在白细胞部分的后续分析需要阻滞溶解剂的活性的情况下，溶解剂的抑制剂实际上是溶解剂系统的一种补体。此种抑制剂通过将pH值(大约6.00至7.25)和重量克分子渗透在浓度(大约300至330毫渗光分子)控制在一个相当狭窄的范围内，来稳定白细胞种群。还可以配制抑制剂来匹配选用于聚焦流式孔分析系统的“鞘”流体的导电性。当根据Coulter等人在美国专利第3，502，974号(上述所列参考文献)中所叙述的技术(RF电流与DC电场结合进行激励)进行分析时，调节抑制剂的组成和体积，来提供5种主要白细胞亚种群的最佳分离。按上述方法处理的血样中的白细胞部分，可通过应用能够进行多参数粒子(细胞)测定的血液分析器;和通过与专门吸附那些在每一种白细胞亚种群的细胞上的一种或几种表面标记的抗血清(即，抗体、结合蛋白等)的免疫化学作用，容易地分离为至少5种亚种群。
图1、2和3是表示实例2的血样的白细胞分类分析的散点图;每一张图中的，X轴都是互不相同的。
图4是表示实例1的血样的白细胞分类分析的散点图。
图5是表示实例5的血样的白细胞分类分析的散点图。
图6是表示实例6的血样的白细胞分类分析的散点图。
本发明的溶解剂系统，包括一种含有令人意想不到的低浓度的溶解剂(最好是低于1.0%(体积))的水溶液。本发明的溶解剂系统的溶解剂，通常可描述为一种水溶性的在水介质中至少部分离解的酸性化合物。如上所述，对于在本发明所预期的各种环境的中使用的此种可溶于水的酸性化合物来说，有许多相互联系的因素是很重要的。这些因素，包括PH、重量克分子渗透压浓度和平衡离子的相容性。为了使红血细胞种群进行合乎要求的溶解，必须将血样酸化。但是，在此种血样的PH值不在大约2.6至4.0的优选范围为的情况下，将白细胞部分分离为独特的亚种群的能力就明显地受到损害。
在溶解的血样的重量克分子渗透压浓度不能保持在低于100毫渗克分子的情况下，此种有效地将白细胞种群分离为其各种亚群的能力，也受到阻碍。因此，在不能将溶解的血样的PH值或重量克分子渗透压浓度保持在所述的参数范围内的情况下，有效地将白细胞种群分离为各种亚种群的能力显然受到损害。
在其些情况下，已经证明离解了的酸性化合物的平衡离子，可导致白细胞部分的分离受到影响的程度。例如，磷酸，即使在可产生适当的PH值和重量克分子渗透压浓度的浓度下，也不能有效地将此种白细胞部分分离为其各种亚种群。一般是假设此种酸(磷酸)的平衡离子以某种未知的方式与白细胞部分相互作用或者是不能与白细胞部分相互作用，从而不能提供由其他水溶性的酸性化合物所提供的分离的程度。
可能还会有其他的是溶解剂所固有的对血样的作用的因素和机理，这些因素和机理导致了本发明的令人意想不到的和出乎意料的结果。到目前为止，只确定了以上列举的三种因素，也不打算暗示本发明的有效性只取决于上述已确定的因素。
本发明的溶解剂最好是一种甲酸、乙酸或甲酸与乙酸的混合物水溶液，其中甲酸是主要的功能组分。简单地将溶解剂加入去离子水中即可配制此种水溶液。加入此种稀释剂的溶解剂的量足以配制溶解剂浓度约为0.05%至0.5%(体积/体积)的溶液。在本发明的优选实施方案中，溶解剂的浓度约为0.1至0.25%(体积/体积)。
在该溶解剂包括一种含有甲酸和乙酸的混合物的情况下，乙酸最好是只能以部分取代有决定性意义的量的甲酸的形式存在，因此，其浓度只在大约0.05至0.10%(体积/体积)。
溶解剂系统，除了溶解剂外，还可以随意地含有非常少量的皂苷(最好是至少大约0.05至0.2%(重量)。目前已充分认识到，作为一种溶解剂，皂苷的有效性是高度取决于浓度的。如果皂苷的浓度低，通常是不起作用的。如果将皂苷用作一种溶解剂时，其浓度必须至少为2%(重量)才能实际上完成红血细胞的基质溶解作用。但是，遗憾的是，在皂苷以溶解有效量存在的情况下，它还能导致白细胞的溶解。因此，应用皂苷作为一种溶解剂，在白血细胞种群中的任何诱导的改变，及其用自动测试仪器进行的后续分类，都必须以它们各自的核的任何一种可觉察的和明显的特性为基础。但是，在临床医生遇到所谓的“形骸细胞”(完整的红细胞膜)干扰以物理和/或电性质的差异为基础的分类鉴定的情况下，在本发明的溶解剂系统中最好是有皂苷存在。如上所述，如果在用纯光度仪器和/或通过免疫化学分析进行分类化鉴定的情况下，不需要将皂苷加入溶解剂系统中。
溶解剂系统中还可以含有其他的常规添加剂，其含量只要未达到与溶解剂系统的主要功能组分(即抗微生物保存剂，例如钠万亩定)不相容的程度。
本发明的溶解剂系统可通过简单地将其用人工加入或自动加入的方法来与全血样品混合，令溶解剂和血样进行短时间的互相作用，然后加入合适的抑制剂来实际上阻滞溶解剂的作用。因此，当将在此种环境中有效的抑制剂加入血样和溶解剂中所含的水混合物中时，必须能够立即阻滞溶解剂的溶解活性。抑制剂的准确配方是可以改变的，而具体的配方则取决于聚焦流式孔分析系统中所使用的溶解剂系统和鞘流体的组成。抑制剂通常是一种含有可溶性盐的水溶液，这些可溶性盐能够有效地实际上阻滞和/或实际上抑制溶解剂的溶解活性并恢复血样的离子平衡。此种恢复离子平衡的作用，可延长存活细胞的存活力并可应用仪器来进行后续分析，此种仪器要求血样具有导电性(含有电解质)，例如应用Coulter Counter 全血分析器。
适用于与本发明的溶解剂组合物配合使用的抑制剂，通常可含有下列4种成份的至少二种成分的任何组合物氯化钠、硫酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠;此外，还含有作为保存剂的叠氮化物。在本发明的上下文中，抑制剂对溶解剂作用的有效性，是由它能快速降低选用于溶解剂系统中的羧酸和不挥发性无机酸的溶解活性的能力来确定的。如上所述，用于白细胞亚种群的分离的方法和仪器，还能够对抑制剂的准确的配方提出某些技术要求(即导电性、PH值等)。更准确地说，当此种分离分析在聚焦流式孔分析系统中进行时，抑制剂的组成和体积对于将5种白细胞亚种群互相进行最佳的分离是具有关链性意义的。在此种类型的分析系统中，还必须调节抑制剂的离子平衡，来获得溶解的血样与鞘流体的令人满意的导电性匹配。在优选的抑制剂配方中，主要的离子及其在溶解剂的一抑制的血样中的相对比值，应该实际上与主要的离子及其在鞘流体中相对比值是相同的。抑制剂的功能组分的相对浓度(此种抑制剂将与本发明的溶解剂系统配合使用)，将在大约1至3%(重量/体积)的氯化钠、大约0.25至0.8%(重量/体积)的碳酸钠或碳酸氢钠以及大约2至4%(重量/体积)的硫酸钠的范围内。最佳的抑制剂的成分的准确相对量通常是由经验来确定的;此种调节的目的是使溶解的血样的PH值达到大约6.0至7.5的范围内，而稳定的溶解血样的最后重量克分子渗透压浓度则达到大约300至330毫渗克分子的范围内。以前在聚焦流式孔系统中已经观察到，通过将最后血样的重量克分子渗透压浓度调节到大约310毫渗克分子，可达到白细胞亚种群的最佳群生。用一种碱性抑制剂来实际上完全中和溶解的血样的酸度，对于聚焦流式孔分析系统是具有关键性意义的。血样的组分(即血纤维蛋白和血小板)对PH是很敏感的，而且在酸性条件下可形成聚集体，此种聚集体可能干扰分离分析(即噪声)或实际上阻塞聚焦流式孔系统的孔。
既不预期也不想要抑制剂也必然能阻止或抑制皂苷(如果存在时)。其理由是十分简单的，因为皂苷在预期的浓度时(大约0.2%(重量))，是一种比较无效的溶解剂。如果在将皂苷加入血样中时，抑制剂也能阻止皂苷的活性的话，那么血样的适当澄清(破坏完整的红血细胞膜)就不会发生。因此，预料在抑制了溶解剂的活性后，皂苷的活性可延续大约5至15秒钟。在某些情况下，可适当地提供一种只适用于皂苷的抑制剂;但是，在目前预期的浓度(低于0.1%)下，还没有可达到或促进本发明的皂苷抑制剂。当然，抑制剂的适合程度是根据关于血样(所研究的被分折物)中的细胞对溶解剂的灵敏度和在进行分析之前溶解剂与这些细胞被分析物接触的时间来确定的。如上所述，抑制剂阻滞了溶解活性，但是它不能完全消除其对血样中的白细胞部分的影响。因此，如果在加入抑制剂和分析血样之间经过一段相当长的时间的话，那么，最好是将白细胞部分固定，来保留所研究的细胞被分析物的特征大小和形状。
在本发明的优选方案中，溶解剂与血样有效接触的时间(从溶解剂与血样混合的时间到加入抑制剂的时间)，必须少于10秒，而最好是6秒或少于6秒。假设溶解剂与血样的活性接触是在室温(大约18至28℃)下进行的，则其活性接触时间间隔，为上面所规定的时间。当然，如果温度超过此水平时，活性接触的时间就会稍微缩短和缩得更短;如果温度低于此水平时，则活性接触的时间就会稍微加长。为了成功地实施本发明的分离方法，具有关键性意义和必不可少的是小心地和准确地控制溶解剂与牺牲的细胞种群(红血细胞)和所需要的细胞部分(白细胞种群)的相互作用的动力学。目前还不准确地知道溶解剂与二种细胞部分之间的反应的机理，而只是显示出此种相互作用的结果。因此，推测在分离分析中是怎样达要这些改进的，是不属于本文的讨范围的，因此，本文并不试图对此种机理进行解释或随后对此种机理提求权利要求。
限制这二种细胞部分与溶解剂的接触，可有效地和有效率地进行红细胞种群的基质溶解作用，而由抑制剂诱导的白细胞种群的外加的微秒改变，可使它们能够进行有效的分离。这二种情况实际上是同时发生的，并同时使分离的白细胞部分保持其天然的免疫化学反应性。
如上所述，溶解剂与血液的接触时间，足以使牺牲的细胞部分产生选择性的破坏性应答，而又同时使白细胞部分产生分离应答;此种改变令人意想不到的可使白细胞种群的至少5种细胞亚种群之间进行实际的分离。此种溶解剂，极不同于惯用的溶解剂(即皂苷、季胺盐)，它不会有害地改变白细胞亚种群中的每一个细胞的表面标记的天然免疫化学应答。对于本发明的此种溶解剂来说，此种质量是独特的。
可将已经与上述溶解剂系统接触的血样，用进行分离鉴定的仪器来进行分离鉴定。此种分离可应用采用美国专利第3，549，994号(本文详细地参考了此文献)、第3，502，974号和第3，989，381号中所叙述的设备来进行。可将上述参考专利中所叙述的发明的特点，具体结合到工业用的仪器中去。简单地说，首先应用自动移液设备，将血样与溶解剂系统混合，来处理血样。溶解剂对牺牲细胞种群(红血细胞)的溶解作用必须同时是快速的和有效的。然后用同样的移液设备将抑制剂加入，来实际上阻滞溶解剂对存活的细胞部分(白细胞)的活性。然后将含有白细胞部分的血样进行每一种个别的细胞亚种群的计数，和/或用此种方式收集的数据来绘制直方图和/或散点图。
本技术领域中的工作人员都知道，在进行Coulter体积测量中所包括的原理叫做“Coulter原理”简单地说，采用coulter原理的仪器的操作，包括测定由于个别细胞通过设计用来测量由于细胞的存在所导致的电压降的传感器时所引致的阻抗的变化。采用此原理的仪器包括二个流体容器或室，在每一个容器或室中装有导电性电解质溶液。将至少二个有相反电性的电极插入该电解质溶液中，其中每一个流体隔室中分别插入一个电极。将其中有血细胞悬浮的电解质溶液样品，通过在二个流体隔室之间的狭窄的通道或锐孔。不过此种狭窄的通道可以具有各种不同的形状，在每一套仪器中，此种通道规定出一个传感区，在此传感区中由于有或无粒子的存在而导致通道中发生可探测出的电性的变化。例如，当导电性比较差的血细胞通过此通道时，取代了其体积与细胞体积相等的电解质溶液，于是由于增加了通道的阻抗而使电压下降。由电压下降所造成的电阻的脉动式起伏可用来进行粒子计数和粒子体积测定。在美国专利第2，656，508号中较详细地叙述了Coulter原理。此种传感和鉴定特定细胞种群的技术，可以通过将coulter原理的测量方法与在传感区中用射频激励细胞的方法相结合来提高。简单地说，此种射频提高作用是根据一个粒子通过血液学分析器的传感区时，可导致传感区中的射频(RF)能量的相移的原理来工作的。此种相移可与细胞种群的物理和组成特性相关联。在美国专利第3，502，974号中较细地叙述了此种细胞的RF分类技术。白细胞分类还可以利用美国专利第3，380，584号(本发明已详细地参考此文献)中所叙述的流式细胞光度术的光学测量原理来进行。
本发明的溶解剂系统，可有效地诱导白细胞部分的微妙改变，来提高用自动细胞计数设备进行白细胞种群的5种独特的亚种群的分类，例如见美国专利第4，412，004号(Ornstein等人，本发明已详细地参考此文献)。如上所述，这些5种独特的亚种群淋巴白细胞亚种群、单核白细胞亚种群和三种粒性的细胞亚种群包括(嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和嗜中性细胞)。白细胞种群中的这些每一种亚种群都具有独特的表面标记。在某些疾病状态下，在一种或几种这些亚种群上的表面标记，可提供一种独特的免疫化学应答，因而有可能在疾病发展的初期就将其诊断出来或确诊。检出在白细胞种群的这些一种或几种亚种群上的这些独特的表面标记，当然是取决于有效地将这些具有特征疾病状态表面标记的细胞实际上与未受疾病影响的细胞分离开来;以及在被分析的血样中的受疾病影响的细胞的相对浓度。
本发明所预期的起始溶解条件，可延续存活的和要将其互相分离开来的细胞种群的存活力。对于其中的大部分细胞来说，预期至少72小时的细胞存活力，将适合于某些类型的免疫化学分析。在本分类方法的某些应用中，将一种或几种这些亚种群在体外保持几小时或甚至可能几天，可能是必需的和适当的。为了达到此种延长的稳定性，将白细胞种群与含有溶解剂/抑制剂混合物的流体部分实际上分离开，随后再将这些细胞悬浮在一种生理介质中是切实可行的。
下列实例用来说明本发明的溶解剂系统的独特优点。在配制和评价此种溶解剂系统对所采用的设备和技术是标准化的或者是上文中所叙述的。除非另行规定，否则在下列实例中所用的份数和百分数均用重量表示。
实施例1用试剂级化学物质配制本发明的溶解剂系统。首先将1.3毫升的90%甲酸与998毫升去离子水混合，配制0.12%(体积/体积)的甲酸溶液。将50微升全血样品(K3EDTA)与800微升的0.12%甲酸溶液一起在室温下(大约20℃)旋动5秒钟，使其缓缓混合。加入400微升的含有0.55%碳酸氢钠、3.0%氯化钠和0.01%叠氮化钠的抑制剂溶液，大约5秒钟后，甲酸的溶解作用即受到抑制。在加入抑制剂后的大约5至10秒钟内，血样即受到抑制并随即可以用流式细胞光度技术来进行分类分析。用于此种分类分析的设备装有测定光散射的氦/氖激光器和硅二极管探测器。应用光学参数分析法来观察白细胞种群和它们的各个参数，即测量消光(零角散射)，和任何一种几种角度范围内的光散射。图4说明用上述方法绘制的血样的散点图。在此散点图上，可鉴定出和用数量表示出白细胞种群的5种独特的亚种群。
实施例2重复实例1的步骤，但是将0.05%(重量/体积)皂苷粉加入含有0.12%甲酸的水溶液中。然后将全血样品(50微升)与600微升溶解剂)混合。加入265微升的含有0.60%碳酸钠和3.00%氯化钠的水溶液，6秒钟后，溶解剂即被抑制。
在溶解组合物中加入皂苷，可有效地消除根据Coulter体积测定时的红细胞碎片的干扰。皂苷的有效性高度取决于温度。要实际上完全消除红细胞碎片的干扰，在完成溶解血样中的红细胞部分后，还需要再延长10秒钟(在大约18至28℃室温下)。在将血样保持在低温(低于18℃)的情况下，需要稍长的时间来通过皂苷有效地消除红细胞碎片的干扰。
在加入抑制剂后大约10至20秒钟内，即可将血样进行分类分析。按实例1中所述的步骤将血样进行光学照相测定。还应用一种ISOTON 鞘流体和DC电场和RF电流测定细胞体积，来对血样中的白细胞种群进行观察，图1说明最后所得到的散点图。在同时得到的图2所表示的光散射对DC的散点图上，可鉴定出和用数量表示出白细胞种群的4种独特的亚种群。而白细胞的第5种亚种群(嗜碱性细胞)则是通过一种栅控二次散点图(gated secondary scattergram)来分离。此种嗜碱性细胞种群描述在图3表示的散点图中。
实例3重复实例2的步骤，应用相同的甲酸/皂苷试剂组合物。用含有3.13%(重量/体积)硫酸钠(无水)、1.45%(重量/体积)氯化钠和0.60%(重量/体积)碳酸钠(无水)的抑制剂来抑制甲酸的溶解活性。按实例2中所叙述的方法，用电光技术来分析血样，散点图的结果类似于图1、2和3的结果。但是，鞘流体改为ISOTON Ⅲ稀释剂。
实例4重复实例3的步骤，但是应用一种浓的溶解的一投制的血样来较快速地获得数据。溶解剂包括0.15%(体积/体积)甲酸和含有0.10%(重量/体积)皂苷粉。用含有2.67%(重量/体积)硫酸钠(无水)、1.24%(重量/体积)氯化钠和0.56%(重量/体积)碳酸钠(无水)的抑制剂来抑制甲酸的溶解活性。
实例5重复实例1的步骤，但是用0.01%(体积/体积)乙酸代替溶解系统中的甲酸。在加入2.0%氯化钠溶液中含有0.25%碳酸氢钠的抑制剂后大约5秒钟，该试剂的活性即受到抑制。在加入抑制剂后的大约5至10秒钟内，血样即受到适当地抑制并随即可以用流式细胞光度技术来进行分类分析。在此分析中所用的设备和分析技术实际上与实例1中所用的设备和分析技术相同。图5中的散点图说明对此血样所进行的分类分析。
实例6重复实例5的步骤，但是，在加入抑制剂前，将血样与溶解剂接触的时间由5秒钟延长至7秒钟。还将碳酸氯钠在2.0%氯化钠溶液中的浓度由0.25%增加到0.375%来稍稍改变抑制剂。图6中的散点图说明白细胞种群的此种分类分析的结果。
实例7重复实例1的步骤，但是应用免疫化学技术来分离和鉴定的细胞种群的各种亚种群。在溶解剂的作用刚抑制后，将血样用一种等渗缓冲液来稀释并用一系列磁粉来顺序地进行打浆，每一种磁粉已用一种不同的只专门吸附一种白细胞种群的抗血清进行了预处理。应用上述详细参考的文献中所叙述的常规磁粉分离技术，可将所吸附的细胞顺序地从血样中分离出来。然后将分离出来来磁粉再进行显示一种或几种疾病状态的表面标记的筛分。
实例8重复进行实例7的步骤，但是将细胞与磁粉分离，然后根据Nature第256卷第495-497页(1975年)中Kahler和Milstein提出的步骤，将该细胞用一种不死的细胞株培养。将按此方式生产的无性繁殖系进行筛分，来生产专门吸附所研究的表面标记的抗血清。
实例9重复实例5的步骤，但是用0.10%(体积/体积)柠檬酸代替溶解剂系统中的乙酸。用柠檬酸代替乙酸后所获得的结果与实例5所获得的结果是相当不多的。
实例10重复实例5的步骤，但是用0.1%(体积/体积)琥珀酸代替溶解剂)系统中的乙酸。用琥珀酸代替乙酸后所获得的结果与实例5所获得的结果是相差不多的。
实例11重复实例5的步骤，但是用0.1%(体积/体积)乳酸代替溶解剂)系统中的乙酸。用乳酸代替乙酸后所获得的结果与实例5所获得的结果是相差不多的。
实例12重复实例5的步骤，但是用0.5%(体积/体积)硫酸代替溶解剂系统中的乙酸。用硫酸代替乙酸后所获得的结果与实例5所获得的结果是相差不多的。
以上内容详尽的说明书和实例，是用来说明本发明的溶解剂、溶解剂系统和方法的某些优选实施方案。本发明人无意将他们的发明的上述这些特殊实施方案解释为是对其发明的范围和宽度的说明，而只是简单地用来支持其所提出的权利要求书。
权利要求
1.一种与全血中的一种或几种细胞组分进行选择性溶解作用的溶解剂系统，所述系统包括一种水溶液，其中含有一种稀释剂和一种分离有效量的实际上是由一种水溶性化合物组成的溶解剂，此种水溶性化合物在水介质中至少部分离解，从而产生游离质子和平衡离子，在将分离有效量的所述化合物加入全血样品中，可(i)将血样的PH值由其生理水平降至大约2.6至4.0的范围内，并同时将血样的重量克分子渗透压浓度保持在至少低于大约100毫渗克分子，(ii)进行红血细胞部分的快速的和实际上是完全的溶血作用，和(iii)进行白细胞部分的微妙改变，来提高进行白细胞种群的至少5种亚种群的分类分析和鉴定的仪器的能力，并在进行所述微妙改变的同时，将白细胞亚种群保持在其实际上是天然的生理状态和/或免疫化学状态。
2.一种进行的血细胞分类分析的试验试剂(test kit)，其中包括(a)一种溶解剂系统，其中含有一种稀释剂和一种分离有效量的实际上是由一种水溶性化合物组成的溶解剂，此种水溶性化合物在水介质中至少部分离解，从而产生游离质子和平衡离子，在将分离有效量的所述化合物加入全血样品中时，可(ⅰ)将血样的PH值由生理水平降至大约2.6至4.0的范围内，并同时将血样的重量克分子渗透压浓度保持在至少低于大约100毫渗克分子分子，(ⅱ)进行红血细胞部分的快速的和实际上是完全的溶血作用，和(ⅲ)进行白细胞部分的微妙改变，来提高进行白细胞种群的至少5种亚种群的分类分析和鉴定的仪器的能力，并在进行所述微妙改变的同时，将白细胞亚种群保持在其实际上是天然的生理状态和/或免疫化学状态。(b)一种实际上是由一种碱性盐水溶液组成的抑制剂，在将其加入血样中时，此种碱性盐水溶液可有效地快速阻滞溶解剂的溶解活性，并同时将溶解的血样稳定在PH值约为6至7.5的范围内而重量克分子渗透浓度则稳定在约为300毫渗克分子的范围内。
3.在一种含有可使全血样品中的红细胞部分进行选择性溶血作用的溶解剂的试剂系统中，可使血样中的白细胞部分进行物理分离和/或分析，其改变措施包括一种碱性盐水溶液，在将其加入血样中时，此种碱性盐水溶液可有效地快速阻滞溶解剂的溶解活性，并同时将溶解的血样稳定在PH值约为6至7.5的范围内而重量克分子渗透压浓度则稳定在300至330毫渗克分子的范围内。
4.一种使全血样品中的红细胞种群进行选择性溶血作用，并同时促进血样中的一种或几种白细胞亚种群的后续分离、鉴定和/或分析的方法，所述的分离、鉴定和/或分析是以白细胞种群的一种或几种物理、生理和/或免疫化学特性为基础的，这些特性显示所研究的亚种群的特征，所述方法包括(a)提供一种水溶性溶解剂系统，其中含有一种稀释剂和一种分离有效量的实际上是由一种水溶性化合物组成的溶解剂，此种水溶性溶解剂在水介质中至少部分离解，从而产生游离质子和平衡离子，在将分离有效量的所述化合物加入全血样品中时，可(ⅰ)将血样的PH值由其生理水平降至大约2.6至4.0的范围内，并同时将血样的重量克分子渗透压浓度保持在至少低于大约100毫渗克分子，(ⅱ)进行红血细胞部分的快速的和实际上是完全的溶血作用，和(ⅲ)进行白细胞部分的微妙改变，来提高进行白细胞种群的至少5种亚种群的分类分析和鉴定的仪器的能力，并在进行所述微妙改变的同时，将白细胞亚种群保持在实际上是天然的生理状态和/或免疫化学状态;(b)将全血样品与分离有效量的溶解剂系统接触;(c)使溶解剂和血样在18至28℃的温度范围内进行一段不超过10秒钟的作用时间;和(d)加入一种抑制剂，阻滞溶解剂对血样中的白细胞部分的作用，所述抑制剂的浓度足以实际上立即阻滞溶解剂的溶解活性并恢复白细胞种群在血样中的生理环境。
全文摘要
本发明的溶解剂包括一种水溶性化合物，此种化合物在水溶液中可至少部分离解并释放出一个质子和一个平衡离子，从而将该血样酸化至PH值约为2.6至4.0。本试剂系统的优点和独特性是意想不到的速度(在室温下通常低于10秒)和使白细胞种群(特别是粒性白细胞种群)进一步分离的能力。在基质溶解后，加入一种抑制剂来阻滞溶解剂系统的活性，从而抑制对白细胞种群的任何进一步的引人注目的改变。
文档编号G01N33/50GK1030481SQ8810167
公开日1989年1月18日 申请日期1988年3月11日 优先权日1987年3月13日
发明者斯蒂芬·拉·莱德斯, 哈罗德·里·克鲁斯, 蒂莫西·杰·费希尔, 特德·塞纳 申请人:库尔特电子公司