一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及涉及生物技术领域，特别涉及一种人类a防御素多肽酶联免疫吸附 试剂盒、制备与检测方法。
【背景技术】
[0002] 防御素蛋白肽（Defensins)属于抗菌肽家族，广泛存在于包括植物、无脊椎动物 和脊椎动物在内的多种生物体。防御素蛋白肽均为分子量2_6kDa的阳离子小分子短肽，含 保守的6个半胱氨酸残基，形成3个典型的分子内二硫键，分为a-防御素和13-防御素两 大类。a-防御素主要存在于人类嗜中性粒细胞的嗜天青颗粒中，亦被称为人类嗜中性粒细 胞肽（Humanneutropholpeptides，HNP)。人类嗜中性粒细胞防御素主要有3种，S卩HNP1、 HNP2和HNP3,具有促进中性粒细胞趋化、增强巨噬细胞吞噬功能、调节补体活性、刺激炎性 因子的表达与释放，以及趋化树突状细胞和T细胞等生物学作用，在机体的天然免疫应答 和获得性免疫应答中发挥非常重要的作用。大量研宄表明，a防御素蛋白表达异常或功能 受损与各种感染免疫性疾病（如重症脓毒症和炎症性肠病等）的发生发展密切相关，并且 在败血症、肺炎、慢性阻塞性肺病等多种疾病的发病和调节中起了关键性的作用。临床研宄 证明，a防御素（HNP)的水平与上述疾病的病情进展、严重程度及预后密切相关，可以发展 为新的临床诊断与病情监测指标。
[0003] 现在检测HNP的方法主要有免疫组化法、免疫印迹（Westernblot)及酶联免疫吸 附测定方法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)。各种方法相互验证，同时又 存在灵敏度、专业性、设施设备条件及成本的影响。目前，以血清学反应原理为基础的ELISA 方法是被广泛接受和推广的方法。与其他检测方法相比，ELISA检测方法具有成本低、检测 设备简单、快速高效等优点，并在不断改进过程中，形成了竞争ELISA，非竞争ELISA，单抗 体ELISA、微波ELISA以及双抗体夹心ELISA方法。目前，市售的检测HNP的双抗夹心试剂 盒，普遍存在检测范围窄、灵敏度低、价格昂贵等缺点。而制备该种试剂盒的关键，是得到良 好的包被抗体和检测抗体。包被抗体以及检测抗体的灵敏度决定了双抗夹心试剂盒的检测 范围及灵敏度。
[0004] 因此，研制高灵敏度的人类嗜中性粒细胞a防御素单克隆以及多克隆抗体，对于 组装一款灵敏度高、范围宽、操作简单便捷的人类嗜中性粒细胞《防御素多肽检测试剂盒 具有重要意义。
[0005] 本发明使用天然防御素偶联白蛋白来免疫，可得到比较优异的兔多抗和鼠单抗， 并组装成试剂盒，灵敏度和精确度都有显著提高。
【发明内容】
[0006] 鉴于现有技术所存在的检测成本高、检测范围窄，灵敏度低等问题，本发明提供一 种人类a防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒，所述检测试剂盒使用了优质的多克隆抗体和 单克隆抗体，具有检测灵敏度高、检测范围宽、操作简单便捷等优点。
[0007] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008] -种人类a防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒（全称为"人类嗜中性粒细胞a防 御素多肽（HNP)酶联免疫吸附试剂盒"），包括：酶标板、HNP蛋白冻干标准品、兔多克隆抗 体、酶标二抗、标准品稀释液、25倍浓洗涤缓冲液、抗体稀释液、TMB显色液、终止液；
[0009] 所述酶标板为鼠抗人HNP单克隆抗体包被的酶标板，所述鼠抗人HNP单克隆抗体 的包被浓度1Ug/mL;
[0010] 所述HNP蛋白冻干标准品从病人痰液中提取并纯化冻干后获得，使用前稀释成不 同浓度，10000pg/mL、4000pg/mL、1600pg/mL、640pg/mL、256、102、41pg/mL;所述稀释时间为 使用前15min;
[0011] 所述兔多克隆抗体为兔抗人HNP多克隆抗体（初始浓度为0. 2mg/mL，使用浓度为 0. 2yg/mL)；
[0012] 所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体；
[0013]所述标准品稀释液为20g/L BSA、0. 2g/L KH2P04、0. 2g/L KC1、2. 9g/L Na2HP04?12H20、8g/LNaCl水溶液；
[0014] 所述样品稀释液为 0? 2g/LKH2P04、0. 2g/LKC1、2. 9g/LNa2HP04 ? 12H20、8g/LNaCl 水溶液；
[0015]所述 25 倍浓洗涤缓冲液为 5g/LKH2P04、5g/LKC1、72. 5g/LNa2HP04 ? 12H20、200g/ LNaCl、体积分数1. 25%Tween-20的水溶液，临用前用纯净水稀释25倍，得到洗涤缓冲液， 现配现用；
[0016] 所述抗体稀释液含有20g/LBSA、lg/LTris、0.2mL质量分数为1%硫柳汞、8g/L NaCl水溶液；
[0017] 所述质量分数1 %的硫柳汞溶液含有l〇g/L硫柳汞，并且所述质量分数1 %的硫柳 汞溶液中丙酮的体积分数10 %、乙醇的体积分数为50 % ;
[0018] 所述酶反应终止液为2mol/LH2S04水溶液。
[0019] 本发明所述的人类a防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒的检测范围为41? 10000pg/mL〇
[0020] 一种人类a防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0021] 1)样本的采集及保存：收集标本如血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细 胞培养上清液、组织匀浆等，置于2?8°C保存，若超过48h或更长时间须冷冻（_20°C 或-70°C)保存；血清、血浆至少作1 : 5稀释（例如，取50yL样品，加样本稀释液200yL， 即为稀释5倍）；
[0022] 2)准备不同浓度HNP蛋白标准液：将10ngHNP蛋白标准品冻干粉用lmL标准品 稀释液稀释成l〇〇〇〇pg/mL，进一步依次以2. 5倍倍比稀释成不同浓度：4000pg/mL、1600pg/ mL、640pg/mL、256pg/mL、102pg/mL、41pg/mL;
[0023] 3)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；设标准孔7孔，依次加入100yL不 同浓度的HNP蛋白标准液，空白孔加100yL标准品稀释液；余孔加待测样品100yL，酶标 板加上覆膜，室温反应60min;
[0024] 4)弃去液体，拍干，用洗涤缓冲液洗涤6次，300yL/孔；
[0025]5)每孔加100yL兔抗人HNP多克隆抗体，室温反应60min;
[0026] 6)弃去液体，拍干，用洗涤缓冲液洗涤6次，300 y L/孔；
[0027] 7)每孔加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体100yL，室温反 应60min，用洗涤缓冲液洗板6次；
[0028] 8)依次每孔加入TMB显色液100 y L，室温避光显色15-30min ;
[0029] 9)依次每孔加终止液50yL，终止反应；
[0030] 10)用酶标仪读取450nm波长处吸光度（OD值）；
[0031] 11)计算样品中HNP浓度：以各标准品的OD值减去空白对照OD值后的净OD值为 纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制出标准曲线（7点图）并以此计算出标准曲线的直 线回归方程。将样品的OD值代入方程式，计算出样品中HNP浓度，再乘以稀释倍数即为样 品中HNP的实际浓度。
[0032] 一种人类a防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒制备方法，包括以下步骤：
[0033] 1)从病人痰液中提取HNP蛋白，冷冻干燥，最大限度的保留HNP蛋白的天然结构及 活性，得到HNP蛋白标准品冻干粉；
[0034] 2)制备HNP完全抗原：
[0035] a)将步骤1)获得的HN