流感病毒的血凝素的测定方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及作为流感病毒的抗原的血凝素的测定方法。
【背景技术】
[0002] 流感病毒属于正粘病毒科，根据存在于病毒内部的核蛋白和基质蛋白的抗原性不 同被分类为A型、B型和C型。每年可见流行的流感病毒是A型和B型，特别是A型病毒， 根据作为颗粒表面抗原的糖蛋白的不同，其血凝素被分类为16种亚型、而神经氨酸苷酶被 分类为9种亚型，是容易发生抗原性变异的病毒。因此，必须预测每个季节的流感流行以选 择疫苗株，还必须随着株的变更来准备作为疫苗的主要抗原的血凝素测定用试剂。
[0003] 现有技术文献 非专利文献 非专利文献I:MahmoodN,HayAJ. ,AnELISAutilizingimmobilisedsnowdrop lectinGNAforthedetectionofenvelopeglycoproteinsofHIVandSIV.JImmunol Methods.，151(1992)9-13; 非专利文献 2:LegasteloisI.等人，Avianglycan-specificIgMmonoclonal antibodiesforthedetectionandquantitationoftypeAandBhaemagglutinins inegg-derivedinfluenzavaccines.JVirolMethods. , 178(2011) 129-136。
【发明内容】
[0004] 发明所要解决的课题 作为血凝素的灵敏度高且样本处理能力高的测定方法，可以列举使用单克隆抗体和多 克隆抗体的夹层ELISA法，但需要株特异性的两种抗体，鉴于抗体的制作期间，难以在新型 疫苗制造株或大流行性病毒的血凝素测定中供给单克隆抗体。而且，在如非专利文献2记 载的使用鸟类的糖链特异性单克隆抗体的测定方法中，由于特殊抗体的缘故，与其说是供 给量等问题，不如说是普及性低的测定方法，而且在动物细胞中扩增的流感病毒的血凝素 测定中无法使用。
[0005] 因此，本发明的目的在于提供流感病毒的血凝素的新型测定方法，与使用两种抗 血凝素抗体的夹层免疫测定法相比，该方法可以在短期间内构建测定系统。
[0006] 用于解决课题的手段 本申请发明人深入研宄的结果，发现凝集素与流感病毒的血凝素结合而不与抗体结 合，想到了若用凝集素和抗血凝素抗体夹持血凝素，则需要的抗血凝素抗体只有一种，与使 用两种抗血凝素抗体的夹层免疫测定法相比可以在短期间内构建测定系统，完成了本发 明。
[0007] S卩，本发明提供通过夹层免疫测定法进行的流感病毒的血凝素的测定方法，该方 法包括：用与流感病毒的血凝素结合而不与抗体结合的凝集素和与该血凝素进行抗原抗体 反应的抗血凝素抗体夹持该血凝素。
[0008] 发明效果 根据本发明，使用一种抗血凝素抗体，通过夹层免疫测定，可以高精度地测定流感病毒 的血凝素。
【附图说明】
[0009] 图1-1是在利用以下的各表面活性剂处理灭活全颗粒病毒后，通过蛋白质印迹显 示基于蔗糖密度梯度离心分离法的馏分分析的图。A.未处理、B. 1.0%的TritonX-IOO处 理、C. 1.0% 的NP-40 处理、D. 1.0% 的Tween80 处理、E. 1.0% 的Brij35 处理、F. 1.0% 的 CHAPS处理、G. 1. 0% 的Zwittergent3-14 处理、H. 1. 0% 的CTAB处理、I. 0. 3% 的SDS处 理、J. 4.OM的尿素处理、K. 3.OM的盐酸胍处理； 图1-2同上； 图2是显示下述实施例中进行的通过夹层免疫测定测得的血凝素浓度与吸光度的关 系的图。
【具体实施方式】
[0010] 如上所述，本发明的方法涉及通过夹层免疫测定法进行的血凝素的测定方法，该 方法是用与流感病毒的血凝素（以下，有时仅称作"血凝素"）结合而不与抗体结合的凝集 素和与该血凝素进行抗原抗体反应的抗血凝素抗体夹持该血凝素。
[0011] 本发明的方法中使用的凝集素是与血凝素结合的凝集素。是否与血凝素结合，可 以通过下述参考例2中具体记载的凝集素印记法（使标记凝集素与转移到PVDF膜上的血 凝素反应，看是否检测到标记）来确认。另外，"不与抗体结合"是指不与与免疫测定中使 用的构成抗体的免疫球蛋白同种、同类的免疫球蛋白（通常是小鼠、兔或绵羊等的IgG)结 合，不与来自小鼠、兔和绵羊等各动物的IgG结合，如下述参考例3中具体记载的那样，可以 根据通过与各动物的HRP标记IgG的ELISA测定的吸光度是否不足阴性对照（空白）平均 值的2倍、优选不足1. 5倍来确认。作为与血凝素结合、而不与抗体结合的凝集素的优选例 子，可以列举：曼陀罗凝集素（DSL)、刺桐凝集素（ECL)和蓖麻凝集素（RCA120)。与血凝素 结合、而不与抗体结合的凝集素既可以单独使用，也可以组合使用两种以上的凝集素。
[0012] 在本发明的方法中，优选将上述凝集素固定在固相上再进行夹层法。作为固相， 可以使用夹层ELISA等周知的夹层免疫测定中使用的任一种固相，可以列举：板、管、珠粒、 膜、凝胶等。作为材质，可以列举：聚苯乙烯、聚丙烯、尼龙、胶乳、玻璃、交联糊精、琼脂糖、交 联琼脂糖、聚丙烯酰胺等。
[0013] 作为使凝集素吸附在这些固相上的方法，可以采用共价键合法、物理吸附法、离子 结合法和生物化学特异性结合法（例如使结合有生物素的凝集素与结合有链霉亲和素的 固相结合等）等。在操作简便方面，特别优选物理吸附法和生物化学特异性结合法。
[0014] 这里，物理吸附法例如可以列举下述方法：将凝集素溶解于含有0. 05% Tween20 (商品名）的pH7~9的缓冲液（例如Tris盐酸缓冲液生理盐水、磷酸缓冲液生理 盐水、碳酸缓冲液等）中，之后加入到固相（例如微量培养板的孔）中，在室温下静置1~ 2小时左右或者在4°C左右静置一夜使其吸附。另外，生物化学特异性结合法可以列举下述 方法：由于结合有链霉亲和素的固相（板或珠粒）有市售，所以例如将凝集素溶解于含有 0. 05%Tween20 (商品名）的pH7~9的缓冲液（例如Tris盐酸缓冲液生理盐水、磷酸缓冲 液生理盐水、碳酸缓冲液等）中，之后添加到市售的结合有链霉亲和素的固相中，在室温下 静置1~2小时左右或者在4°C左右静置一夜使其吸附（参照下述实施例）。在物理吸附 法、生物化学特异性结合法中，对与固相反应的凝集素的浓度均没有特别限定，通常以终浓 度计为10Wg/mL~60jUg/mL左右。
[0015] 在吸附了凝集素的固相表面，有时会残留没有吸附凝集素的表面部分，若其中吸 附了样本中的血凝素或其他分子种类，则有可能无法获得正确的测定结果。因此，优选在样 本与固相接触之前添加封闭物质，以包被没有吸附凝集素的部分。作为这样的封闭物质，可 以列举：可以由哺乳动物、例如牛等采集的血清白蛋白、酪蛋白、乳蛋白、乳酸发酵物、胶原 以及它们的分解物质等，另外，还可以使用作为免疫测定中的封闭物质来销售的物质。
[0016] 本发明的方法中使用的抗血凝素抗体是与流感病毒的血凝素进行抗原抗体反应 的物质，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。在进行流感病毒的型特异性测定时，通 常使用与各型血凝素进行特异性抗原抗体反应的抗血凝素单克隆抗体。
[0017] 抗血凝素抗体通常被标记。作为用于标记的标记物质，可以列举：酶（过氧化物 酶、碱性磷酸酶、-半乳糖苷酶、萤光素酶、乙酰胆碱酯酶等）、同位素（ 125i、131i、3h等）、荧 光色素（氨基苯二酰肼（发光氨）、异硫氰酸荧光素、7-羟基香豆素（umbellifer〇ne)、7-氨 基-4-甲基香豆素-3-乙酸等）、化学发光物质、半抗原、生物素、亲和素（例如链霉亲和素 等），但只要是通常能够用于蛋白标记的物质，则没有特别限定。需要说明的是，这里的标记 物质还包括：象生物素这样不直接检测其本身，而是在组合使用与该物质具有特异性结合 能力的物质（例如亲和素）上结合有可检测的标记的物质的方法中使用的物质。
[0018] 上述的抗体标记方法可以从适合于标记物质的公知方法中适当选择，例如在标记 酶时，可以从戊二醛法、过碘酸交联法、马来酰亚胺交联法、碳化二亚胺法、活化酯法等中适 当选择；用放射性同位素标记时，可以从氯胺T法、乳过氧化物酶法等中适当选择。需要 说明的是，关于标记抗血凝素抗体，由于针对各种型的抗体均有销售，所以还可以使用市售 品。
[0019] 在本发明的方法中，通常使上述的固相化凝集素和标记抗血凝素抗体、与含有流 感病毒血凝素的样本反应，清洗后测定与固相结合的标记。
[0020] 适用本发明的方法的样本只要是含有流感病毒血凝素的样本即可，可以是含有流 感病毒颗粒的样本，也可以是从中提取血凝素而获得的样本。提取血凝素时，不管血凝素 的存在形式如何均可测定，无论是存在于病毒颗粒中还是以游离血凝素的形式存在均可测 定，测定精度也有所提高，因此优选。提取血凝素时，可以使用阳离子型或阴离子型表面活 性剂（以下，将两者统称为"离子型表面活性剂"）。作为离子型表面活性剂的优选例子，可 以列举：十二烷基硫酸钠（SDS)、十二烷基硫酸锂（LiDS)、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)、 十六烷基三甲基氯化铵（CTAC)和氯化十六烷基吡啶（HPC)，特别优选为十六烷基三甲基溴 化铵（CTAB)。离子型表面活性剂可以单独使用，也可以将两种以上组合使用。
[0021] 用离子型表面活性剂进行处理的条件优选在样本中添加离子型表面活性剂使终 浓度达到0. 1~2. 0%，在37°C下静置或搅拌1~2小时左右，可以从病毒颗粒中提取血凝 素，但并不限于此。
[0022] 可以使固相化凝集素、样本和标记抗血凝素抗体同时反应，也可以首先使固相化 凝集素与样本反应，清洗后再与标记抗血凝素抗体反应，还可以先使样本与标记抗血凝素 抗体反应形成免疫复合物，之后再与固相化凝集素反应。各反应可以在室温下进行30分 钟~120分钟左右。反应系统中的血凝素的终浓度范围通常是Ing/mL~I#g/mL左右，标 记抗血凝素抗体的终浓度范围通常是0. 2~50 #g/mL左右。
[0023] 反应后，清洗固相，测定与固相结合的标记。作为清洗液，例如可以列举：添加有 Tween(商品名）系表面活性剂等表面活性剂的缓冲液（例如磷酸缓冲液、磷酸缓冲液生理 盐水、Tris盐酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液生理盐水）等。作为标记物质的检测方法，根据使 用的标记物质而不同，例如在标记物质中使用生物素时，可以列举下述方法等：经由链霉亲 和素等使过氧化物酶等酶与包含生物素作为标记物质的复合体结合，加入作为该酶的底物 的四甲基联苯胺等显色物质和过氧化氢水，再根据吸光度的变化测定酶反应产物的显色程 度。另外，在标记物质中使用荧光物质或化学发光物质时，可以列举测定反应后的溶液的荧 光或发光的方法等。
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