一种心肌组织传感器及心肌组织芯片的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程、生物医学工程与传感技术交叉领域，特别涉及一种心肌组织传感器及心肌组织芯片的制备方法。
【背景技术】
[0002]心肌细胞是心肌组织的主要构成细胞，主要分布于心壁和临心大血管上，心肌细胞呈短圆柱形纤维状，具有明显的方向性。相比于主要以代谢功能为主的肾细胞、肝细胞等细胞，心肌细胞的主要功能是收缩和舒张，以此来实现心脏的泵血功能以推动血液循环。有关心肌组织的损伤和病变会导致各种心脏病和心肌疾病，均具有很高的发病率和死亡率，严重威胁人类生存和生活质量。据统计，在美国，约有480万充血性心力衰竭患者，而且每年新发患者超过40万。心肌疾病的有效治疗离不开相关药物的开发，而药物的筛选和试验是新药物投入使用中不可或缺的一个环节。传统的动物或者人体的体内试验存在影响因素不可控、试验结果难重复、试验过程费时耗力以及相关的伦理问题等固有缺点。而细胞(组织)传感器的出现则为解决这些问题提供了新的思路。
[0003]细胞传感器是以细胞作为主要功能性元件，识别和感知被测物并按一定规律转换成可识别信号的器件或装置。因其具有体积小、响应快、可实现原位在线监测等特点，在环境评估、食品安全以及药物筛选等领域应用前景广泛。近30年来，细胞培养技术和微机电制造技术的发展更是为细胞传感器的发展提供了良好的平台，使得细胞传感器在生物、化学和医学分析领域得到了越来越多的关注和应用。传统的心肌细胞传感器均以细胞的电生理信号为检测量，在此基础上相继出现了电压钳细胞传感器、膜片钳细胞传感器、场效应晶体管细胞传感器、微电极阵列细胞传感器以及光寻址电位传感器等。上述各种检测细胞电信号的传感器存在制作工艺复杂，生物相容性以及信号信噪比有待提高等问题。FeinbergAW等(Feinberg AW, et.al, Muscular thin films for building actuators and poweringdevices.Science 2007 ；317:1366 - 70.)于 2007 年提出一种肌肉薄膜(muscular thinfilm，MTF)技术，将肌肉细胞种植在热敏感型高分子材料上来制作三维肌肉组织，并用此来测试肌肉组织在外界刺激下的收缩变形量，为心肌细胞的响应检测提供了一种新的手段。另一方面，在进行细胞传感器系统设计时，生物相容性是必须要考虑的一个方面，要测试细胞的生理活性，细胞和器件表面必须要很好地耦合，也即细胞能在器件表面容易黏附生长，而传统的细胞种植技术难以保证细胞与器件的很好耦合，从而极大地影响了检测精度。
[0004]细胞3D打印(cell printing)技术是近年来出现的一种在体外构造三维多细胞体系的先进技术，该技术是快速成型技术和生物制造技术的有机结合。在细胞打印过程中，细胞(或细胞聚集体)与溶胶(水凝胶的前驱体)同时置于或者含细胞的培养液单独置于打印机的喷头中，由计算机控制含细胞液滴的沉积位置，在指定的位置逐点打印，在打印完一层的基础上继续打印另一层，层层叠加形成三维多细胞-凝胶体系。与传统技术相比，细胞打印的优势主要体现在可在时间和空间上精确沉积不同种类的细胞，可控性大，可以形成具有多种结构的堆积体。
【发明内容】
[0005]本发明针对已有技术的不足之处，提供一种心肌组织传感器及心肌组织芯片的制备方法，旨在提供一种新型的可检测心肌组织收缩量的心肌组织传感器，并将细胞打印技术引入心肌组织芯片的制备中，使其具有采集信号信噪比高，心肌细胞与器件可耦合良好等优点。
[0006]本发明的技术方案如下:
[0007]一种心肌组织传感器，所述传感器包括心肌组织芯片和辅助部件；所述辅助部件包括上模、下模、上电极、下电极、感光板、平行光光源以及数据采集系统；所述上模设有第一流体通道、第二流体通道、导向凸槽以及上凹槽；所述下膜设有培养腔、芯片槽、下凹槽以及导向凹槽；所述上模和下模通过导向凸槽和导向凹槽定向安装在一起；所述心肌组织芯片置于芯片槽中；所述上电极和下电极分别位于上模和下模内部并与上模和下模一体成型；上电极与电源相连，下电极下部位于芯片槽上，并与芯片槽中的心肌组织芯片紧密接触；所述感光板置于上模的上凹槽中，并与数据采集系统相连；所述平行光光源置于下模的下凹槽中。
[0008]上述技术方案中，其特征在于:所述上模和下模均采用聚碳酸酯材料，所述上电极和下电极采用钛合金材料。
[0009]本发明所述的心肌组织芯片，其特征在于该心肌组织芯片的制备方法包括以下步骤:
[0010]I)在一块消毒后的玻璃片的表面贴上一层胶布；
[0011]2)用激光成型机在胶布上进行第一次切割，形成至少5个方形轮廓，每个方形轮廓长度为6?8mm，宽度为0.6?1mm，相互间隔0.1?0.3mm，并移除切下的方形胶布片；
[0012]3)制备质量体积浓度为10%?50%的聚N-异丙基丙烯酰胺溶液，用旋转涂覆法将其均匀涂在玻璃片的含胶布侧，固化后移除胶布，留下方形的聚N-异丙基丙烯酰胺层；
[0013]4)将聚二甲基硅氧烷加热融化后，用旋转涂覆法将其涂到玻璃片上，固化处理后，用激光成型机沿着第二次切割轨迹(407)将聚二甲基硅氧烷切割成中间相连、两侧呈多个“悬臂梁” (408)结构，两侧“悬臂梁”间距为0.6?Imm ;
[0014]5)制备质量体积浓度为0.1?20 %的水凝胶溶液和质量体积浓度为0.1?20 %的交联剂溶液，提取或者诱导心肌细胞制成细胞密度为I X 17?2 X 10 7个/ml的心肌细胞悬浮液，将心肌细胞混入水凝胶溶液中制成细胞密度为I X 16?5X 10 6个/ml的含心肌细胞的水凝胶溶液；将心肌细胞悬浮液装入喷洒式喷头I中，交联剂溶液装入喷洒式喷头2中，含;L.、肌细胞的水减I父洛液装入挤压式喂'头中；用由唆洒式喂'头1、喂'洒式喂'头2和挤压式喷头组成的复合喷头在“悬臂梁”上进行逐层打印，挤压式喷头挤出的丝状水凝胶经喷洒式喷头2喷出的交联剂溶液交联后形成水凝胶丝(502)，然后用喷洒式喷头I在水凝胶丝表面喷洒一层心肌细胞悬浮液形成心肌细胞层(501)，重复挤出、交联、喷洒等操作后形成具有多层细胞的心肌组织芯片，层与层之间的水凝胶丝相互平行；
[0015]6)将该心肌组织芯片置于所述的辅助部件中的芯片槽中，经脉动培养后形成跳动一致的心肌组织芯片。
[0016]优选地，步骤2)中用激光成型机在胶布上切割8?15个方形轮廓。
[0017]本发明所述心肌组织芯片的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述的水凝胶溶液的溶质为海藻酸钠、胶原、透明质酸、基质胶、右旋糖、壳聚糖、纤维连接蛋白、明胶和纤维蛋白原和基质胶中的至少一种，所述交联剂为凝血酶、氯化钙或过磷酸钠中的至少一种。
[0018]本发明所述心肌组织芯片的制备方法，其特征在于，步骤6)中所述的脉动培养，其过程为将培养液从辅助部件的第一流体通道流入培养腔，从第二流体通道流出，流动速度为10?50mL/min，循环流动40?50h。
[0019]与现有技术相比，本发明有以下优点及突出性的技术效果:①本发明的心肌组织传感器可采集心肌组织的收缩信号，而且平行光源的使用提高了信号的采集精度。②本发明在制备心肌组织芯片过程中利用细胞打印技术