L~5mL，充分混旋，超声 15min，8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱。取3CC HLB固相小柱依次以3mL 甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0. 5mL/min~1. OmL/min ;再以3mL 去离子水和〇. 5%甲醇水溶液【本发明中0. 5%甲醇水溶液是指：甲醇水溶液中甲醇的体积 分数为0. 5%，以下不再赘述】先后淋洗小柱；用4mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50°C快速 浓缩仪上吹干，残渣用500 y L~1000 y L初始流动相定容，过0. 22 y m微孔有机滤膜，滤 液供液相色谱-串联质谱仪分析。
[0052] 4、仪器检测
[0053] 液相色谱-串联质谱仪条件
[0054] 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：
[0055] 色谱柱：kinetex C18 (3. OmmX 50mm，2. 6 y m)柱或等效色谱柱；
[0056] 流动相及梯度洗脱条件见表1 ;
[0057] 表1流动相和梯度洗脱条件
[0058]
[0059] 进样量：lyL~10yL;
[0060] 扫描方式：正离子扫描（ESI+);
[0061] 检测方式：多反应监测（MRM);
[0062] 电喷雾电压：5500V;
[0063] 离子源温度：650°C ;
[0064] 雾化气压力：55psi ;
[0065] 气帘气压力：50psi ;
[0066] 辅助气压力：50psi ;
[0067] 监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。
[0068] 表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能
[0069]
[0070] *雷公藤内酯甲M+18
[0071] 5、记录和计算
[0072] 记录各样品及标准品平行进样2~3次中目标物的保留时间及峰面积值，按公式 (1)计算回收率：
[0073]
[0074] 式中：
[0075] R-回收率；
[0076] A添一添加样品中标准物质的峰面积平均值；
[0077] W纯一标准物质浓度，单位为微克每毫升（y g/mL);
[0078] V添一添加样品的定容体积，单位为毫升（mL);
[0079] A纯一标准物质的峰面积平均值；
[0080] M添一添加样品中标准物质的添加量，单位为微克（yg)。
[0081] 6、定性结果评价
[0082] 6.1、阴性结果评价
[0083] 如果样品未出现与标准品Rt值相同的色谱峰，且添加样品相应目标物的回收率 在60%以上，则阴性结果可靠。
[0084] 如果添加样品中未出现与标准品Rt值相同的色谱峰或回收率低于60%，则阴性 结果不可靠。
[0085] 如果添加样品的添加含量< 0. 02 y g/mL时，可不计算回收率，则阴性结果按以下 方式评价：
[0086] 如果案件样品未出现与标准品Rt值相同的色谱峰，添加样品的色谱峰信噪比大 于10,则阴性结果可靠。
[0087] 如果添加样品中未出现与标准品Rt值相同的色谱峰或添加样品的色谱峰的信噪 比小于等于10,则阴性结果不可靠。
[0088] 6. 2阳性结果评价
[0089] 如果样品中出现与目标物相同的两对定性离子对，其色谱峰保留时间与添加样品 中目标物的色谱峰保留时间比较，相对误差在±2. 5%之内，且所选择的相对离子对丰度比 与添加样品中的相对离子对丰度比之相对误差不超过表3规定的范围，空白样品中未出现 相应的色谱峰，则阳性结果可靠。相关的液相色谱-串联质谱图参见图1~图4。
[0090] 如果空白样品中出现与添加样品中目标物保留时间一致的色谱峰，且定性离子对 及相对丰度一致，则阳性结果不可靠。
[0091] 本发明中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素在血样中的检 出限为Ing/mL。
[0092] 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
[0093]
[0094] 实施例2定量分析
[0095] 1、试剂同实施例1
[0096] 2、仪器与材料同实施例1
[0097] 3、样品萃取
[0098] 准确量取案件样品1.OmL~2.OmL或1. 0g~2. 0g平行两份；另取相同基质的空 白样品两份，分别添加相应目标物标准品（添加量应与案件样品粗测量相近）制备成添加 样品，混匀。其他同实施例1。
[0099] 4、仪器检测同实施例1
[0100] 5、记录和计算
[0101] 5. 1、计算药物含量
[0102] 记录各样品平行进样2~3次中目标物峰面积值，按公式（2)计算含量：
[0103]
[0104] 式中：
[0105] W-单位质量样品中目标物质的含量，单位为微克每克（yg/g)或微克每毫升 (yg/mL)；
[0106] A样一样品中目标物的峰面积平均值；
[0107] M添一添加样品中标准物质的添加量，单位为微克（yg);
[0108] V样一样品的定容体积，单位为毫升（mL);
[0109] A添一添加样品中目标物的峰面积平均值；
[0110] M样一样品的取样量，单位为克（g)或毫升（mL);
[0111] V添一添加样品的定容体积，单位为毫升（mL)。
[0112] 5. 2、计算相对相差
[0113] 记录两份平行操作的样品含量，按公式（3)计算相对相差：
[0114]
[0115] 式中：
[0116] RD-相对相差；
[0117] XI、X2 -两份样品平行定量测定的含量数值；
[0118] Z-两份样品平行定量测定含量的平均值。
[0119] 6、定量结果评价
[0120] 如果案件样品中目标物含量的RD > 20%，定量数据不可靠。如果目标物含量的 RD< 20%，定量数据可靠。其含量按两份案件样品的平均值计算。
[0121] 实施例3利用非新鲜血液对本发明的方法进行评价
[0122] 1、试剂，同实施例1。
[0123] 2、仪器和材料，同实施例1。
[0124] 3、样品萃取
[0125] 分别取空白的非新鲜血液2.OmL于具塞试管中，分别添加雷公藤内酯甲、雷公藤 内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准品制备成添加样品，混匀。
[0126] 上述样品中分别加一定量的氢氧化钠溶液调pH为9,加入10.0 mL乙酸乙酯，振荡 lOmin，高速离心10min。分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相（对 二次提取后的无机相进行高效液相色谱分析，样品的提取率为99. 9% )，置于50°C浓缩仪 上挥干。残渣用500 y L初始流动相定容，过0. 22 y m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串 联质谱仪分析。
[0127] 4、仪器检测
[0128] 液相色谱-串联质谱仪条件
[0129] 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：
[0130] 色谱柱：kinetex C18 (3. OmmX 50mm，2. 6 y m)柱或等效色谱柱；
[0131] 流动相及梯度洗脱条件见表1 ;
[0132] 表1流动相和梯度洗脱条件
[0133]
[0134]进样量：lyL ~10yL;
[0135] 扫描方式：正离子扫描（ESI+);
[0136] 检测方式：多反应监测（MRM);
[0137] 电喷雾电压：5500V;
[0138] 离子源温度：650°C ;
[0139] 雾化气压力：55psi ;
[0140] 气帘气压力：50psi ;
[0141] 辅助气压力：50psi ;
[0142] 监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。
[0143] 表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能
[0144]
[0145] *雷公藤内酯甲M+18。
[0146] 雷公藤内醋甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为 87. 6%、93. 5%、97. 8% ;RSD%分别为 3. 6、3. 2、1. 0。
[0147] 雷公藤内醋酮添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为 87. 7%、92. 8%、96. 7% ;RSD%分别为 3. 5、3. 0、1. 0。
[0148] 雷公藤甲素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为 88. 3%、94. 1%、97. 4% ;RSD%分别为 3. 8、3. 1、1. 1。
[0149] 雷公藤红素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为 87. 1%、93. 9%、98. 5% ;RSD%分别为 3. 2、3. 3、1. 0。
[0150] 雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素在10~500ng/mL浓度范 围内均有着良好的线性关系。
[0151] 雷公藤内醋甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分 别为 1. 32、2. 97、2. 15, RSD% (日间）分别为 3. 06、2. 82、4. 06。
[0152] 雷公藤内酯酮添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分 别为 1. 30、2. 78、2. 13, RSD% (日间）分别为 3. 12、2. 68、4. 02。