[0153] 雷公藤甲素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分别 为 1. 30、2. 95、2. 25, RSD% (日间）分别为 3. 01、2. 78、4. 11。
[0154] 雷公藤红素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分别 为 1. 18、2. 90、2. 07, RSD% (日间）分别为 3. 07、2. 71、4. 12。
[0155] 以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为2ng/mL，以信噪比3/1计，该方法的最小 检出限为0. 5ng/mL。
[0156] 实施例4利用新鲜血液对本发明的方法进行评价
[0157] 1、试剂，同实施例1。
[0158] 2、仪器和材料，同实施例1。
[0159] 3、样品萃取
[0160] 取空白的新鲜血液2. OmL于具塞试管中，分别添加雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、 雷公藤甲素和雷公藤红素标准品制备成添加样品，混匀。
[0161] 分别加入pH 5. 8磷酸盐缓冲液5mL，充分混旋，超声15min，8000r/min以上高速 离心20min，取上清液待过柱。取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后 的上清液分别过柱，流速为〇. 5mL/min ;再以3mL去离子水和0. 5%甲醇水溶液先后淋洗小 柱；用4mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50°C快速浓缩仪上吹干，残渣用1000 yL初始流动相 定容，过0. 22 y m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
[0162] 4、仪器检测
[0163] 液相色谱-串联质谱仪条件
[0164] 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：
[0165] 色谱柱：kinetexC18 (3. OmmX 50mm，2. 6 y m)柱或等效色谱柱；
[0166] 流动相及梯度洗脱条件见表1 ;
[0167] 表1流动相和梯度洗脱条件
[0168]
[0169]进样量：lyL ~10yL;
[0170] 扫描方式：正离子扫描（ESI+);
[0171] 检测方式：多反应监测（MRM);
[0172] 电喷雾电压：5500V;
[0173] 离子源温度：650°C ;
[0174] 雾化气压力：55psi ;
[0175] 气帘气压力：50psi ;
[0176] 辅助气压力：50psi ;
[0177] 监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。
[0178] 表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能
[0179]
[0180] *雷公藤内酯甲M+18。
[0181] 雷公藤内醋甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为 88. 2%、95. 6%、99. 1% ;RSD%分别为 3. 2、3. 0、1. 5。
[0182] 雷公藤内醋酮添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为 87. 7%、92. 8%、96. 7% ;RSD%分别为 3. 5、3. 0、1. 0。
[0183] 雷公藤甲素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为 92. 2%、97. 0%、99. 5% ;RSD%分别为 3. 3、3. 0、1. 0。
[0184] 雷公藤红素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为 89. 1%、94. 2%、99. 7% ;RSD%分别为 3. 4、3. 2、1. 4。
[0185] 雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素在10~500ng/mL浓度范 围内均有着良好的线性关系。
[0186] 雷公藤内醋甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分 别为 1. 35、2. 86、2. 45, RSD% (日间）分别为 3. 11、2. 53、4. 00。
[0187] 雷公藤内酯酮添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分 别为 1. 44、2. 63、2. 22, RSD% (日间）分别为 3. 31、2. 78、4. 03。
[0188] 雷公藤甲素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分别 为 1. 26、2. 89、2. 36, RSD% (日间）分别为 3. 01、2. 96、4. 08。
[0189] 雷公藤红素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分别 为 1. 23、2. 93、2. 23, RSD% (日间）分别为 3. 10、2. 51、4. 03。
[0190] 以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为2ng/mL，以信噪比3/1计，该方法的最小 检出限为0. 5ng/mL。
[0191] 实施例3和实施例4中，回收率的计算、线性关系的得出、以及日内和日间精密 度，均采用现有技术中的常规方法：以测得的添加各生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯 酮、雷公藤甲素或雷公藤红素的峰面积与相同浓度雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲 素或雷公藤红素标准工作溶液峰面积的比值来计算回收率。用测得的雷公藤内酯甲、雷公 藤内酯酮、雷公藤甲素或雷公藤红素的峰面积（Y)对生物样品待萃取标准液中雷公藤内酯 甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素或雷公藤红素浓度（X)求得线性回归，得到回归方程，进而 得到线性关系。计算雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素或雷公藤红素峰面积的相对 标准偏差，得到日内精密度；连续测三天，计算雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素或 雷公藤红素峰面积三天的相对标准偏差，得到日间精密度。
【主权项】
1. 雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检 验方法，其特征在于，包括如下步骤： a)取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调 pH9~10,加入乙酸乙酯，振荡lOmin，高速离心10min ;分离有机相后，加有机溶剂进行第二 次提取，合并两次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣用初始流动相定容，过0. 22 y m微 孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析；b)样品分析： 色谱柱：kinetex C18 ;进样量：1 y L~10 y L ;流动相：A为含0? 1 %甲酸的IOmM甲酸 铵，B 为甲醇；梯度洗脱：0? 2min，A 为 95%，B 为 5% ;3. Omin，A 为 5%，B 为 95% ;5. Omin，A 为5%，8为95%;5.11^11^为95%，8为5%;7.〇111111^为95%，8为5% ;流速为0.511117 min ； 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描（ESI+);检测方式：多反应监测（MRM); 电喷雾电压：5500V ;离子源温度：650°C ;雾化气压力：55psi ;气帘气压力：50psi ;辅助气 压力：50psi。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其中a)样品前处理还能够替换为：取生物液体样 品或生物组织样品剪碎于具塞试管中；加入pH 5. 8磷酸盐缓冲液，充分混旋，超声15min， 8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱；取3CCHLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL 水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为〇. 5mL/min~1.0 mL/min ;再以3mL去离子水 和0. 5%甲醇水溶液先后淋洗小柱；用4mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50°C快速浓缩仪上 吹干，残渣用初始流动相定容，过0. 22 y m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分 析。3. 根据权利要求1-2所述的检测方法，其中液体样品为血液、尿液、唾液；所述组织样 品为肝脏、肾脏。4. 根据权利要求1-2所述的检测方法，其中C18柱为3. OmmX 50mm，2. 6 y m柱或等效色 谱柱。5. 根据权利要求1-2所述的检测方法，其中取液体样品1.0 mL-2. OmL ;或者组织样品 I. 0g-2. Og06. 根据权利要求1-2所述的检测方法，其中乙酸乙酯的加入量为5. OmL-IO. OmL。7. 根据权利要求1-2所述的检测方法，其中残渣用500 y L-1000 y L初始流动相定容。8. 根据权利要求2所述的检测方法，其中磷酸盐缓冲液的加入量为3mL-5mL。9. 权利要求1-2所述的检测方法的应用，其特征在于，应用于生物样品中雷公藤内酯 甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑 物证的检验。10. 根据权利要求6所述的应用，其中生物样品为血、尿、肝、肾。
【专利摘要】本发明涉及雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法，包括如下步骤：取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min；分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干；残渣用初始流动相定容，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。本发明的检测方法简单高效、快速灵敏、准确度高，具有广泛的实用性，能够应用于生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN104991020
【申请号】CN201510370319
【发明人】王芳琳, 栾玉静, 应剑波, 姚伊人, 刘耀
【申请人】公安部物证鉴定中心
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月29日