抗体的快速检测。
[0051] 2.本发明利用杂合噬菌体实现P53抗体的快速检测，能够大幅度降低血清P53抗 体检测成本。
[0052] 3.该试纸条具有特异性高，检测过程简单，结果准确可靠，检测过程在10分钟内 便可判定结果，方便实现P53抗体检测的临床推广应用。
[0053] 总之，本发明成本低廉，操作简单，检测过程中无需特殊仪器设备，因此能广泛应 用于医院及科学研究，特别适用于农村及基层单位使用。这对肿瘤早期发现具有重要意义。
【附图说明】
[0054] 图1为SDS-PAGE及Westernblot鉴定展示P53蛋白表位的杂合噬菌体。其中，A 为SDS-PAGE结果，1 :野生噬菌体，2-3 :杂合噬菌体。B为Westernblot验证杂合噬菌体， 1 :健康人血清，2-3 :两例P53抗体阳性癌症患者血清。
[0055] 图2为本发明试纸条的结构示意图。其中，1为底板；2为包被膜；3为胶体金垫； 4为样品垫；5为吸水垫；6为检测线（T线）；7为质控线（C线)。
[0056] 图3为本发明试纸条检测结果示意图。其中，a为阳性；b为阴性；c和d为无效。
[0057] 图4为本发明试纸条检测结果效果图。其中，a为阳性；b为阴性；c和d为无效。
【具体实施方式】
[0058] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0059] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060] 嗤菌体载体pfd8SY:记载于"MalikPI,PerhamRN.Newvectorsforpeptide displayonthesurfaceoffilamentousbacteriophage.Gene. 1996, 171 (1) :49-51.，'一 文，公众可从东北师范大学获得。
[0061] 辅助噬菌体M13K07 :为NEWENGLANDBioLabs产品，Catalog:N0315S。
[0062] 大肠杆菌NM522 :为AgilentTechnologies产品，CatalogNumber: 200270。
[0063] 实施例1、基于噬菌体展示技术快速检测血清P53抗体的试纸条的制备
[0064] -、展不有P53蛋白表位多肽的杂合嗤菌体的制备
[0065] 1、利用商业生物公司的DNA合成仪进行P53蛋白表位SQAMDDLMLS(序列1)基因 片段的合成，即合成如下两个互补的DNA片段，并分别于94°C90s及65°C5min条件下使其 互补结合成具有粘性末端的双链DNA。
[0066] 5' -GGAGGGTTCTCAAGCTATGGATGATTTAATGTTATCTCCAT-3' ；
[0067] 5, -CGATGGAGATAACATTAAATCATCCATAGCTTGAGAACCCTCCGC-3，。
[0068] 2、以噬菌体载体pfd8SY为原始质粒，进行重组载体构建，具体过程如下：取5iig 噬菌体载体pfd8SY，分别加入5ill限制性内切酶SacII和BstBI，加入对应的酶切缓冲 液和无菌水至总体积200ill。酶切5h后，回收载体骨架大片段。
[0069] 3、将步骤2回收的载体骨架大片段与步骤1获得的具有粘性末端(与SacII和 BstBI酶切后产生的粘性末端相匹配)的双链DNA按摩尔浓度1:5混合，10ill混合液中加 入1illT4DNA连接酶和1ill缓冲液，16°C，过夜连接。
[0070] 4、将步骤3获得的连接产物转化大肠杆菌NM522感受态细胞，涂平板37°C过夜培 养。
[0071] 5、挑单克隆，过夜培养后进行PCR验证，将验证正确的阳性克隆送去公司进行测 序，将经测序表明将噬菌体载体pfd8SY的酶切位点SacII和BstBI之间的小片段替换为 "AGGGT+序列2+CC"的重组载体命名为pfd8SY-P53。
[0072] 在重组载体pfd8SY_P53中，序列2所示的P53蛋白表位多肽的编码基因插入到了 pVDI外壳蛋白编码基因的5'端。
[0073] 6、将测序正确的菌液接种到5mlLB液体培养基(含有100iig/mlAmp)中，37°C， lOOrpm过夜培养。
[0074] 7、次日，取2ml过夜培养的菌液加入到200mlLB液体培养基(含有100iig/ mlAmp)中扩大培养至菌体终浓度为10ncfu/ml，加入辅助噬菌体M13K07,使辅助噬菌体 M13K07最终浓度为0? 05ng/ml，37°C，200rpm(旋转半径16mm)震荡培养3小时。
[0075] 8、5000rpm(相当于2599g)离心lOmin，弃上清。将沉淀用等倍体积的新的LB液 体培养基(含有lOOyg/mlAmp)重悬，37°C200rpm(旋转半径为16mm)震荡培养5小时。
[0076] 9、7000rpm(相当于5095g)离心lOmim，将上清按照6:1的比例加入到PEG/NaCl 溶液（即上清和PEG/NaCl液体的体积配比为6:1)中，充分溶解后，4°C静置12-14h。
[0077]其中，所述PEG/NaCl溶液的溶剂为水，溶质及其浓度为：3MNaCl，167g/ LPEG8000。
[0078] 10、8000rpm(相当于6773g)离心30min，弃上清，控干后用1/10所述上清体积的 TE溶液(配方：TE溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：1.0mMEDTA，10mMTris-HCl，pH8. 0) 溶解沉淀，12000rpm(相当于16421g)离心20min，弃沉淀。
[0079] 11、向上清中加入1/6体积的PEG/NaCl溶液(配方同上)，4°C静置4h，12000rpm(相 当于16421g)离心20min，弃上清，所得沉淀即为展示有P53蛋白多肽的杂合噬菌体。
[0080] 12、用TE溶液(配方同上）溶解沉淀，通过在270nm处测定样品的0D值，代入下列 公式算出杂合噬菌体的浓度（Ug/u1) :〇D270X稀释倍数/3. 84。
[0081] 13、将制备的杂合噬菌体进行SDS-PAGE及Westernblot分析。
[0082]其中，SDS-PAGE为直接针对杂合噬菌体自身进行鉴定，同时以未展示P53蛋白表 位的野生型噬菌体（即辅助噬菌体M13K07)为对照。Westernblot分析为：以健康人血清 (临床证实P53抗体阴性）和两例临床证实P53抗体阳性癌症患者血清为待测样本，采用杂 合噬菌体作为抗原，辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司产 品，其产品目录号为ZDR-5301)为二抗，进行鉴定。
[0083] 结果显示，图1中A所示的SDS-PAGE图谱中，杂合噬菌体样品得到了大小约为 6. 5KD的rpVID蛋白（pVID外壳蛋白与P53蛋白表位多肽形成的融合蛋白）；而作为对照的野 生型噬菌体样品中得到的是比所述rpW蛋白略小一些的所述pW外壳蛋白，与预期结果 一致。证明以上制备的杂合噬菌体成功展示了P53蛋白SQAMDDLMLS表位。另外，Western blot分析结果显示该表位能够特异性的识别癌症患者血清P53抗体（图1中B)。
[0084] 二、包被膜的制备
[0085] 1、试剂的配制
[0086] 0? 05MpH9. 6 碳酸盐缓冲液：0? 16gNa2C03 与 0? 29gNaHC03 溶解于 100ml超纯水 中，作为包被缓冲液。置4°C备用,有效期15天。
[0087] 0? 01MpH7. 2 磷酸盐缓冲液：8gNaCl、0. 2gKC1、2. 9gNa2HP03 ?12H20、0. 2gKH2P04 溶解于l〇〇〇ml超纯水。
[0088] 2、包被膜制备
[0089] 一方面，用包被缓冲液将步骤一制备得到的所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体调 节浓度至1000yg/ml，然后使用划膜仪喷在硝酸纤维素膜（NC膜，上海杰一生物技术有限 公司产品，其产品目录号为NC-bllO)的检测线上；另一方面，用0. 01MpH7. 2磷酸盐缓冲 液将人IgG(上海生工生物工程股份有限公司产品，其产品目录号为AB10501)调节浓度至 1000yg/ml，然后使用划膜仪喷在硝酸纤维素膜（NC膜）的质控线上，保证检测线和质控线 的两线垂直距离为5_，应细致均匀。最后将所述硝酸纤维素膜（NC膜)于60°C烘干4小时。
[0090] 三、胶体金垫的制备
[0091] 1、氯金酸的配制
[0092] 用超纯水溶解氯金酸，配制溶液，置4°C备用，有效期7天。100ml0. 01%氯金酸溶 液配方：〇. 〇lg氯金酸溶于l〇〇ml超纯水。
[0093] 2、柠檬酸三钠的配制
[0094] 用超纯水溶解柠檬酸三钠，配成1%溶液，置4°C备用，有效期7天。lOOrnll%柠檬 酸三钠溶液配方：lg柠檬酸三钠溶解于l〇〇ml超纯水。
[0095] 3、0? 2M碳酸钾的配制
[0096] 超纯水配制，4°C备用，有效期7天。100ml0. 2M碳酸钾溶液配方：2. 76g碳酸钾溶 解于100ml超纯水。
[0097] 4、金标抗体封闭液的配制
[0098] l%PEG-20000,10%BSA，0. 01MpH7. 2磷酸盐缓冲液(配方同上)，4°C备用，有效期7 天。100ml金标抗体封闭液配方：10gBSA、lgPEG-20000溶解于100ml0.01MpH7. 2磷酸盐 缓冲液。
[0099] 5、金标抗体保存液的配制
[0100] 1%BSA，l%PEG-20000,5% 蔗糖，0? 25%Tween-20,0. 01MpH7. 2 磷酸盐缓冲液（配方 同上)，4°C备用，有效期7天。100ml金标抗体保存液配方：lgBSA、lgPEG-20000、5g蔗糖、 25Tween-20 溶解于lOOmlO. 01MpH7. 2 磷酸盐缓冲液。
[0101] 6、胶体金的制备
[0102] 取0. 01%氯金酸水溶液100ml，加热煮沸，加入1%柠檬酸三钠4ml，继续煮沸，直至 溶液变成鲜红色即停止加热，冷却至4°C备用。
[0103] 7、金标抗体的制