158] 混合样品（120yL)和预处理液（100yL)，通过以室温温育7分钟，将该样品在终 浓度0. 014N的氢氧化钠的存在下处理。
[0159] 【（2)中和工序】
[0160] 混合上述的处理工序中得到的样品和含与实施例1相同的酸性物质的试剂 (80yL)，通过以室温温育5分钟，中和该样品。
[0161] 【3.HBs抗原的检测】
[0162]【⑴形成工序】
[0163] 在反应比色杯（HISCL用反应比色杯：Sysmex株式会社制）内混合中和工序中得 到的样品（300yL)和实施例1和相同的标记抗体试剂（100yL)，于42°C温育9分钟。向 此反应比色杯添加与实施例1相同的第1抗体试剂（100yL)，于42°C温育9分钟。再者， 向此反应比色杯添加与实施例1相同的载体粒子试剂（75yL)，于42°C温育10分钟而进行 形成工序。
[0164]【⑵回收工序】
[0165] 在含形成工序中得到的样品的反应比色杯中，使用集磁装置（MINITUBEMAG SEPARATOR:SPHER0TECH公司制）进行磁分离，通过除去该比色杯内的上清，回收载体粒 子。向此反应比色杯添加清洗液，再进行磁分离而清洗载体粒子。其中，进行2次由600yL 的清洗液的清洗、进行1次由150yL的清洗液的清洗。再有，通过向HISCL清洗液（Sysmex 株式会社）添加NaCl而使NaCl浓度成0. 4M而得到此工序中使用的清洗液。
[0166]【（3)转移工序】
[0167] 向含回收工序中得到的样品的反应比色杯添加与实施例1相同的游离剂 (33yL)，于38°C温育5分钟。接下来，使用上述的集磁装置进行磁分离，回收上清33yL。 此后，测定工序使用HISCL2000i(Sysmex株式会社制）进行。具体而言，在HISCL2000i中 进行以下操作。首先，向回收的上清添加与实施例1相同的载体粒子试剂（60yL)，通过 于42 °C温育约6分钟，实施转移工序。再有，在本实施例中，其中添加的载体粒子试剂中的 磁性粒子对应于固相。于是，从固相除去上清，添加上述（2)的回收工序中使用的清洗液 (300yL)，再通过除去上清而进行清洗。将同样的清洗操作重复5次。
[0168] 【（4)测定工序】
[0169] 向转移工序中得到的固相添加HISCLR4试剂（50yL)和HISCLR5试剂（100yL) (Sysmex株式会社），于42°C温育5分钟。然后，进行发光强度（counts)的测定。测定结果 不于以下的表4及表5。
[0170] 【表4】
[0171]
[0172]【表5】
[0173]
[0174] 如表4及表5所示，由2SD法知，用本发明的HBs的检测方法，在从血清转换面板 制备的含有HBs抗体的样品中，即使是HBs抗原浓度是0. 0002IU/mL的HBs抗原微量，也可 检测HBs抗原。
[0175] 【实施例3 :预处理液的碱性物质的浓度的差异对于HBs抗原的灵敏度的影响的探 讨】
[0176] 【1.材料】
[0177] 【⑴样品】
[0178] 将自HBV阳性患者得到的3种血清（HBV6290-6、HBV11048-6及HBV6272-6 :均获 自ZeptoMetrix公司）作为样品使用。
[0179] 【（2)预处理液】
[0180] 【⑴预处理液1】
[0181]将以0. 15N的浓度含氢氧化钠（Nacalaitesque株式会社）、以0. 4%的浓度含 Brij(注册商标）35 (和光纯药工业株式会社）、及以I. 2M的浓度含尿素（岸田化学株式会 社）的水溶液作为预处理液1使用。
[0182] 【（ii)预处理液2】
[0183] 将以0.6251^的浓度含氢氧化钠（似〇&1&1七689脱株式会社）、以0.4%的浓度含 Brij(注册商标）35 (和光纯药工业株式会社）、及以I. 2M的浓度含尿素（岸田化学株式会 社）的水溶液作为预处理液2使用。
[0184] 【2?样品的预处理】
[0185] 【⑴处理工序】
[0186] 混合样品（120yL)和预处理液1 (100yL)，通过以室温温育7分钟，将该样品在终 浓度0. 06N的氢氧化钠的存在下处理。另外，对于相同的样品，代替预处理液1而使用预处 理液2进行同样的操作。即，混合样品（120iiL)和预处理液2 (SOiiL)，通过以室温温育7 分钟，将该样品在终浓度0. 25N的氢氧化钠的存在下处理。
[0187] 【（2)中和工序】
[0188] 混合上述的处理工序中得到的样品和含与实施例1相同的酸性物质的试剂 (80yL)，通过以室温温育5分钟，中和该样品。
[0189]【3.HBs抗原的检测】
[0190]【⑴形成工序】
[0191] 在反应比色杯（HISCL用反应比色杯：Sysmex株式会社制）内混合中和工序中得 到的样品（300yL)和实施例1和相同的标记抗体试剂（100yL)，于42°C温育9分钟。向 此反应比色杯添加与实施例1相同的第1抗体试剂（100yL)，于42tC温育9分钟。再者， 向此反应比色杯添加与实施例1相同的载体粒子试剂（75yL)，于42°C温育10分钟，进行 形成工序。
[0192]【⑵回收工序】
[0193] 在含形成工序中得到的样品的反应比色杯中，使用集磁装置（MINITUBEMAG SEPARATOR:SPHER0TECH公司制）进行磁分离，通过除去该比色杯内的上清，回收载体粒 子。向此反应比色杯添加清洗液，再进行磁分离而清洗载体粒子。其中，将由600yL的清洗 液的清洗进行2次、将由150yL的清洗液的清洗进行1次。再有，向HISCL清洗液（Sysmex 株式会社）添加NaCl而使NaCl浓度成0. 4M而得到此工序中使用的清洗液。
[0194] 【（3)转移工序】
[0195] 向含回收工序中得到的样品的反应比色杯添加与实施例1相同的游离剂 (33yL)，于38°C温育5分钟。接下来，使用上述的集磁装置进行磁分离，回收上清33yL。 此后、测定工序使用HISCL2000i(Sysmex株式会社制）进行。具体而言，在HISCL2000i中 进行以下操作。首先，向回收的上清添加与实施例1相同的载体粒子试剂（60yL)，通过 于42 °C温育约6分钟，实施转移工序。再有，在本实施例中，其中添加的载体粒子试剂中的 磁性粒子对应于固相。然后，从固相除去上清，添加上述（2)的回收工序中使用的清洗液 (300yL)，再通过除去上清进行清洗。将同样的清洗操作重复5次。
[0196] 【（4)测定工序】
[0197] 向转移工序中得到的固相添加HISCLR4试剂（50yL)和HISCLR5试剂（100yL) (Sysmex株式会社），于42°C温育5分钟。然后，进行发光强度（counts)的测定。另外，对 于用上述的预处理液2处理的样品，也进行与用预处理液1处理的样品同样的检测操作。测 定结果示于图1~图3。
[0198] 从图1~图3,通过使用预处理液1的本发明的HBs抗原的检测方法，与使用如预 处理液2-样的碱物质的浓度高的预处理液的HBs抗原的检测方法比，得到2. 5倍以上的 发光强度。从而知，由本发明的HBs抗原的检测方法可以更高灵敏度检测HBs抗原。
[0199] 本申请与2013年1月28日申请的日本国专利申请特愿2013-013167号相关，这 些专利权利要求、说明书、附图及摘要全部通过引用并入本说明书中。
【主权项】
1. 用于检测HBs抗原的样品的预处理方法，其包括： 通过将疑似含HBs抗原的样品和含有碱性物质的预处理液混合至上述碱性物质的终 浓度成0.012~0. 15N而处理上述样品的工序，及 将处理工序中得到的样品用含有酸性物质的试剂中和的工序。 2. HBs抗原的检测方法，其包括： 通过将疑似含HBs抗原的样品和含有碱性物质的预处理液混合至上述碱性物质的终 浓度成〇. 012~0. 15N而处理上述样品的工序， 将处理工序中得到的样品用含有酸性物质的试剂中和的工序， 向中和工序中得到的样品添加与HBs抗原结合的标记抗体、载体粒子、以及与HBs抗原 及上述载体粒子结合的第1抗体，在上述载体粒子上形成含JBs抗原、上述标记抗体及上述 第1抗体的复合物的工序， 选择性地回收形成工序中得到的样品中的载体粒子的工序， 使回收工序中得到的载体粒子上的复合物游离，转移到与上述载体粒子不同的固相的 工序， 测定转移工序中得到的固相上的复合物中含的标记抗体的标记的工序，及 基于测定工序中得到的结果，检测疑似含上述HBs抗原的样品中的HBs抗原的工序。3. 权利要求1或2所述的方法，其中碱性物质是强碱。4. 权利要求3所述的方法，其中强碱是选自碱金属及碱土金属的氢氧化物、氢化物及 酰胺化物的至少1种。5. 权利要求3或4所述的方法，其中强碱是选自氢氧化钠、氢氧化钾及氢氧化镁的至少 1种。6. 权利要求1~5之任一项所述的方法，其中预处理液再含非离子性表面活性剂。7. 权利要求6所述的方法，其中非离子性表面活性剂是聚氧乙烯系非离子性表面活性 剂。8. 权利要求1~7之任一项所述的方法，其中预处理液再含离液剂。9. 权利要求8所述的方法，其中离液剂是选自尿素、胍盐酸盐、水杨酸钠、硫代氰酸钠、 过氯酸钠、乙酰胺及甲酰胺的至少1种。10. 权利要求1~9之任一项所述的方法，其中酸性物质是选自柠檬酸、醋酸、乳酸、苹 果酸、琥珀酸、磷酸、蚁酸、富马酸、酒石酸、盐酸及硫酸的至少1种。11. 权利要求2或引用权利要求2的权利要求3~10之任一项所述的方法，其中 载体粒子是固定与第1抗体结合的第2抗体的粒子， 形成工序是使在载体粒子上形成含JBs抗原、标记抗体、第1抗体及第2抗体的复合物 的工序， 转移工序是通过使第1抗体和第2抗体的结合解离，使由HBs抗原、标记抗体及第1抗 体组成的复合物游离，使转移到与载体粒子不同的固相的工序。12. 用于检测HBs抗原的预处理用试剂盒，其含： 含有碱性物质的第1试剂，和 含有酸性物质的第2试剂。13. 权利要求12所述的试剂盒，其中碱性物质是强碱。14. 权利要求13所述的试剂盒，其中强碱是选自碱金属及碱土金属的氢氧化物、氢化 物及酰胺化物的至少1种。15. 权利要求13或14所述的试剂盒，其中强碱是选自氢氧化钠、氢氧化钾及氢氧化镁 的至少1种。
【专利摘要】本发明涉及用于检测作为B型肝炎病毒的表面抗原的HBs抗原的样品的预处理方法及利用该方法的HBs抗原的检测方法。另外，本发明涉及用于检测HBs抗原的预处理用试剂盒。NITE BP-148320121213
【IPC分类】G01N33/576, G01N33/53, G01N33/543
【公开号】CN105074470
【申请号】CN201480006278
【发明人】山垣内孝博, 高马卓也, 丸木麻里, 武田和彦
【申请人】希森美康株式会社
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年1月27日
【公告号】EP2950099A1, US20150330982, WO2014115878A1