光度值。
[0131]
[0132] 以标准品溶液浓度（ng/mL)为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线（图1)。 该标准曲线的函数关系式为y = -18. 95Ln(x)+43. 087, R2= 0. 9918.
[0133] 4、样品中残留磺胺药物浓度的测定
[0134] 检测样品为牛奶：牛奶用样品稀释液按1:5(牛奶：样品稀释液）的体积比进行稀 释后，4°C 1000 Orpm离心，取50 μ L上清液用于检测。
[0135] 检测样品为奶粉：称取Ig奶粉，溶于5mL样品稀释液中，混合均匀，取50 μ L用于 检测。
[0136] 检测样品为尿液：直接取50 μ L尿液用于检测。
[0137] 检测样品为鸡肉、鱼、虾及蛋类：称取5g均质样品，加入IOmL乙腈水溶液 水=9:1)，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，用ImL样品稀释液 重悬，取50 μ L用于检测。
[0138] 检测样品为蜂蜜：称取5g样品，加入15mL去离子水，于祸旋仪上充分混合lmin， 过Oasis固相萃取柱后（利用离子交换，将目标物富集和纯化），先用5mL去离子水洗柱，负 压下抽干，再用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用ImL样品稀释液重悬，取50 μ L用 于检测。
[0139] 将步骤3中的不同浓度的磺胺二甲基嘧啶标准品溶液替换为待测样品溶液，其余 操作步骤不变，测定每孔待测样品溶液的吸光度值OD 45。值。用每个浓度的待测样品溶液的 吸光度平均值（B)除以阴性对照孔的吸光度值（Β。）再乘以100%，得到百分吸光度值。
[0140]
[0141] 将百分吸光度值代入标准曲线的函数关系式y = -18. 95Ln(x)+43. 087,即得到样 品溶液中磺胺药物的残留量。
[0142] 二、试剂盒准确度检测
[0143] 向不含磺胺类药物的样品中添加磺胺二甲基嘧啶的标准品，使磺胺二甲基嘧啶标 准品在样品中的终浓度分别为30 μ g/L (或30 μ g/kg)、60 μ g/L (或60 μ g/kg)。将含有浓 度为30 μ g/L (或30 μ g/kg)(真实值）或60 μ g/L (或60 μ g/kg)(真实值）磺胺二甲基啼 啶的样品，按照一中步骤4的测定方法进行样品中磺胺二甲基嘧啶含量的测定，得到每个 样品的测定值。
[0144] 从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，同一批次的试剂盒每个 实验重复5次，分别计算变异系数。
[0145] 回收率的计算方法：RG =测定值与真实值的比值X 100% ;
[0146] 变异系数的计算方法：CV=(各平行样品的标准差与各平行样品平均值的比 值）X100% ;
[0147] 批内变异系数的计算方法：批内CV =同一次测定中各平行样品的变异系数的平 均值。
[0148] 批间变异系数的计算方法：批间CV =同一样品在不同批次测定结果的变异系数 的平均值。
[0149] 结果见表1，所有样品中磺胺二甲基嘧啶的回收率在72. 2% -97. 5%，批内变异系 数在6. 4% -9. 9%，批间变异系数在9. 8% -13. 0%。结果表明本发明的检测磺胺药物的试 剂盒的检测结果稳定，准确度高。
[0150] 表1、试剂盒准确度的检测结果
[0151]
[0152] 三、试剂盒灵敏度检测
[0153] 采用样品稀释液分别溶解磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺 胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、 磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲 基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁挫、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺 硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑等磺胺药物样品，配置 成如下浓度梯度的溶液：50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL 和 I. 6ng/ mL。实验设3次重复。按照步骤一中的操作方法分别计算蛋白质flop分别对磺胺二甲基嘧 啶、磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺 噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒 嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲 基异噁挫、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、 氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑样品的最低检测限（LOD) ICS。值。
[0154] 结果如下：
[0155] 1)吸光度值与每孔所加入的各标准品浓度成反比，证明所表达纯化得到的蛋白质 flop具有识别多种磺胺药物的特性，并呈现线性关系，说明该蛋白质flop可用于多种磺胺 药物的检测。
[0156] 2)各种药物的最低检测限：以各种药物的IC8。为最低检测限（LOD):阴性对照孔 (即不添加磺胺药物溶液的孔）的吸光度值为B。，各实验孔的吸光度值为B，当B/B。为80% 时所对应的标准品溶液的浓度即为最低检测限（IC S。)。结果见表2,该试剂盒的对于磺胺药 物的最低检测限的范围是〇. 92-16. 44ng/mL，对于磺胺P比啶的检测限最低为0. 92ng/mL，具 有很高的灵敏度。
[0157] 表2、多种磺胺药物的最低检测限
[0158] CN 105137086 A IX m "ti 12/20 页
[0160] 四、试剂盒保存期
[0161] 试剂盒保存条件为2_8°C，经过12个月的测定，根据实施例2中待测样品中残 留磺胺药物的检测、试剂盒准确度检测和试剂盒灵敏度检测，试剂盒的最大吸光度值（零 标准）、最低检测限（LOD)IC 8。值、磺胺药物添加实际测定值均在正常范围之内。结果如 表3所示，所有样品中磺胺二甲基嘧啶的添加回收率在70. 5% -89. 3%，批内变异系数在 8. 1 % -14. 6%，批间变异系数在14. 3% -16. 0%。结果如表4所示，该试剂盒的对于磺胺药 物的最低检测限的范围是1. 92-17. 44ng/mL。
[0162] 表3、试剂盒准确度的检测结果
[0163] LlN 丄UOld/USb A I ^ 丄 J/ZU JM
[0164] 表4、多种磺胺药物的最低检测限
[0165]
[0166] CN 105137086 A VL 14/2U 贝
[0167] 考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37°C保存的条 件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。结果如 表5所示，所有样品中磺胺二甲基嘧啶的添加回收率在70. 5% -89. 3%，批内变异系数在 8. 7% -15. 0%，批间变异系数在14. 3% -18. 9%。结果如表6所示，该试剂盒的对于磺胺药 物的最低检测限的范围是1. 92-17. 54ng/mL。
[0168] 表5、试剂盒准确度的检测结果
[0169] CN 105137086 A IX m "ti 15/20 页
[0171] 表6、多种磺胺药物的最低检测限
[0172] CN 105137086 A VL 16/2U 贝
[0173] 考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入_20°C冰箱冷冻8天，测定结果也表明 试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2_8°C至少可以保存12个月以 上。如表7所示所有样品中磺胺二甲基嘧啶的添加回收率在65. 1% -86. 4%，批内变异系 数在12. 1% -15. 0%，批间变异系数在15. 3% -18. 8%。结果如表8所示，该试剂盒的对于 磺胺药物的最低检测限的范围是1. 82-18. 54ng/mL。
[0174] 表7、试剂盒准确度的检测结果
[0175]
[0176] CN 105137086 A VL I丫/ZU 贝
[0177] 表8、多种磺胺药物的最低检测限
[0178]
[0179] 实施例3、检测磺胺药物的胶体金试纸条
[0180] 本实施例中各个试剂的配置如下：
[0181] 浓度为0. 05M，pH值为9. 6的碳酸钠溶液的配制：1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,加 水定容至1L。
[0182] 浓度为 0· 01M，pH 值为 7. 4 的 PBS 缓冲液的配制：8g NaCl、0. 2g KC1、3. 53g Na2HPO4 · 12Η20、(λ 24g KH2PO4, IL 去离子水。
[0183] 浓度为 0· 05M，pH 值为 L 0 的 PBS 缓冲液的配制：溶液 A : 17. 9g Na2HPO4 · 12H20, IL 去离子水；溶液B :8. 6g KH2PO4 ·2Η20, IL去离子水；取60mL溶液A和40mL溶液B，加入8. 5g NaCl，混合均匀。
[0184] -、胶体金试纸条的制备
[0185] 1、包被原的制备
[0186] 用DCC法将半抗原4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸（CS)偶联于卵清白蛋白 (OVA)上。
[0187] a.将半抗原4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸溶于ImL DMF中，配置成浓度为 0. 2mM的4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸溶液；
[0188] b.在ImL浓度为0. 2mM的4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸溶液中依次加入二环 己基碳二亚胺（DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)，使得DCC的浓度为0. 3mM，NHS的浓度为 0. 6mM，将此混合液在室温下搅拌2h，获得溶液A ;
[0189] 取IOmg的OVA溶解于2mL碳酸盐缓冲液中，室温搅拌至HRP溶解。
[0190] c.取IOmg的OVA溶解于2mL浓度为0· 05M，pH值为9.