>[0045]实施例1:以浙农934和富锌3号成熟水稻品系为待测材料、嘉育293品种作为对照；将待测水稻和标准品水稻脱壳后，分别获得相应的糙米；取大小基本一致的待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下操作:
[0046]1.将4粒水稻糙米装入1mL玻璃试管中，然后加入质量浓度为4%的NaOH溶液lmL，在恒温培养箱中于35°C糊化6h，取出后于振荡器上震荡2min，振荡频率为300?350r/mino
[0047]2.在步骤I的所得物中加入0.5mL浓度为2M的盐酸进行中和。
[0048]3.在步骤2的所得物中加入质量浓度为20%的三乙醇胺溶液0.5mL、质量分数为0.1%的二乙基二硫代氨基甲酸钠(铜试剂)溶液lmL、质量分数为0.05%的盐酸羟胺溶液lmL、质量浓度为20%的乳化剂0P-10水溶液0.5mL ;pH = 9的Tris-HCl缓冲溶液(浓度为1M) 1.5mL ;振荡摇匀后静止lOmin。
[0049]4.在步骤3的所得物中加入0.6mL质量浓度为0.1 %的2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚(5-Br-PADAP)染色液，振荡摇匀后静止20min。
[0050]该5-Br-PADAP染色液是5-Br-PADAP的质量浓度为0.1 %的乙醇溶液；
[0051]备注说明:静止后会出现分层，未溶解的部分沉淀下来，本发明对上层的清液进行颜色比较。即，以上层的清液作为待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物。
[0052]5.将步骤4所得的待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色的比较。
[0053]高锌含量水稻的待测糙米反应物颜色明显深于标准品水稻糙米的反应物颜色，如图1所示。待测水稻富锌3号糙米反应物的颜色明显比标准品水稻糙米的反应物颜色要深；普通品系浙农934糙米反应物的颜色则明显比标准品水稻糙米的反应物颜色要浅。在彩色照片下，浙农934反应物颜色为浅红棕色，嘉育293反应物颜色为红棕色，富锌3号反应物颜色为深红棕色。
[0054]备注说明:
[0055]利用ICP-MS方法进行浙农934、富锌3号和对照嘉育293水稻样品锌含量的精确定量测定，结果显示富锌3号水稻品系的含锌量为35.87mg/kg，明显高于对照嘉育293的含锌量(25.56mg/kg);而浙农934水稻品系的含锌量为20.45mg/kg，明显低于对照嘉育293。
[0056]根据以上结论能证明:本发明的快速筛选方法的结果可以应用到稻米锌含量的快速筛选实践。
[0057]对比实验1:将上述实施例1测定步骤中的Tris-HCl缓冲溶液改用不同的pH、用量。
[0058]结果表明；实验研究了不同的缓冲液用量及pH值对吸光度的影响，结果如图3、4所示。缓冲液PH为9，用量在1.5mL时，标准溶液显色的吸光度最大。因此，本发明选用pH为9的缓冲液1.5mL。
[0059]对比实验2:显色剂的用量会影响吸光度的大小，设置了 7个梯度(0.3,0.4,0.5、0.6,0.7,0.8,0.9mL)的5-Br-PADAP乙醇溶液用量，研究了对吸光度的影响。
[0060]实验表明；当0.1 %的5-Br-PADAP乙醇溶液用量在0.6-0.9mL时，吸光度稳定，且达到最大值(如图2所示)。
[0061]对比实验3:乳化剂OP的用量会影响吸光度的大小，将上述实施例1测定步骤中的乳化剂OP改用不同的含量，研究了对吸光度的影响。
[0062]实验表明；当20%的乳化剂OP用量在0.5mL时，吸光度稳定，且达到最大值(如图5所示)。
[0063]备注说明:由于锌标准溶液与5-Br-PADAP乙醇溶液反应后在可见分光光度计波长555nm处的吸光度达到最大值，吸光度的大小反映了颜色的深浅及锌含量的高低，不同锌含量之间吸光度差距越大，表明在掩蔽剂存在下，上述水稻糙米中的锌与5-Br-PADAP乙醇溶液颜色越灵敏，不同锌含量稻米反应物颜色差距越大，即越容易通过简单的目测分辨稻米间锌含量差距。
[0064]实施例2:不同锌含量的水稻品种(系)与对照嘉育293糙米的反应物颜色对比验证试验。
[0065]按照实施例1所述方法进行检查，不同水稻品种(系)的糙米(浙农934、浙农35、嘉育293、胜泰I号、富锌3号)锌含量的染色比较图结果如图6所示。结果表明，浙农934、浙农35、嘉育293、胜泰I号、富锌3号的颜色依次加深。在彩色图中，浙农934反应物颜色为浅红棕色，浙农35反应物颜色为较浅红棕色，嘉育293反应物颜色为红棕色，胜泰I号反应物颜色为较深红棕色，富锌3号反应物颜色为深红棕色。
[0066]结果显示:糙米的反应物颜色深浅与米粉锌含量高低成正比，颜色越深其锌含量越尚。
[0067]备注说明:
[0068]利用ICP-MS方法精确测定浙农934、浙农35、富锌3号、嘉育293、胜泰I号等水稻样品的锌含量，分别为 20.45、22.58、25.56、31.23、35.87mg/kg。
[0069]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.富锌水稻快速筛选方法，其特征是包括如下步骤: 对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤I)?4); 1)、糙米糊化: 取用水稻糙米4粒，加入质量浓度为4% NaOH溶液0.8?1.2mL，在恒温培养箱中于34.5?35.5°C糊化5.5?6.5h，取出后于振荡器上震荡1.5?2.5min，振荡频率为300?350r/min ； 2)、在步骤I)的所得物中加入0.4?0.6mL浓度为2M的盐酸进行中和； 3)、在步骤2)的所得物中加入质量浓度为20%的三乙醇胺溶液0.4?0.6mL、质量浓度为0.1 %的二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液0.9?1.lmL、质量浓度为0.05%的盐酸羟胺溶液0.9?1.lmL、质量浓度为20%的乳化剂OP水溶液0.4?0.6mL、pH = 9的Tris-HCl缓冲溶液1.4?1.6mL ;振荡摇匀后静止8?12min ; 4)、在步骤3)的所得物中加入0.6?0.9mL的2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)_5_ 二乙氨基酚染色液，振荡摇匀后静止8?20min ;取上层清液，从而分别得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糖米反应物； 该2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)-5- 二乙氨基酚染色液是2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)_5_ 二乙氨基酚的质量浓度为0.1 %的乙醇溶液； 5)、将步骤4)所得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色比较； 当待测水稻糙米反应物的颜色比标准品水稻的糙米反应物颜色深时，则说明待测水稻糙米含锌量高于标准品水稻，颜色越深则锌含量越高。2.根据权利要求1所述的富锌水稻快速筛选方法，其特征是: 乳化剂OP为乳化剂0P-10。3.根据权利要求1或2所述的富锌水稻快速筛选方法，其特征是: 所述步骤I)中=NaOH溶液的用量为lmL，在恒温培养箱中于35°C糊化6h，取出后于振荡器上震荡2min ; 所述步骤2)中盐酸的用量为0.5mL ; 所述步骤3)中三乙醇胺溶液的用量为0.5mL，二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液的用量为ImL,盐酸羟胺溶液的用量为lmL，乳化剂OP水溶液的用量为0.5mL ;pH = 9的Tris-HCl缓冲溶液的用量为1.5mL ; 所述步骤4)中2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)-5- 二乙氨基酚染色液的用量为0.6mL。
【专利摘要】本发明公开了一种富锌水稻快速筛选方法，对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤1)～4)；1)、糙米糊化；2)、在步骤1)的所得物中加入盐酸进行中和；3)、在步骤2)的所得物中加入三乙醇胺溶液、二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液、盐酸羟胺溶液、乳化剂OP水溶液、Tris-HCl缓冲溶液，摇匀后静止；4)、在步骤3)的所得物中加入5-Br-PADAP染色液，摇匀后静止，取上层清液；5)、将步骤4)所得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色比较；当待测水稻糙米反应物的颜色比标准品水稻的糙米反应物颜色深时，则说明待测水稻糙米含锌量高于标准品水稻，颜色越深则锌含量越高。
【IPC分类】G01N21/78
【公开号】CN105158241
【申请号】CN201510519572
【发明人】石春海, 张世玺, 金哓丽, 吴建国, 王克敏
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年8月21日