一种驴特征性多肽及其在检测驴皮源性成分中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种动物物种和动物源性成分鉴定的方法，具体涉及一种驴皮源性成 分的检测方法；此外，本发明还涉及检测驴皮源性成分的特征性多肽。
【背景技术】
[0002] 阿胶作为一种传统名贵中药，已有数千年的食用历史，具有补血滋阴，润燥，止血 的功效。中国药典规定，阿胶为马科动物驴Equus asinus L的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩 制成的固体胶。纯正的阿胶必需来自百分百的驴皮，方能保证产品的功效。从原料生物分类 学上看，驴属于奇蹄目马科驴属，包括非洲野驴、藏野驴、中亚野驴、家驴等品种。其中中国 饲养的家驴包括关中驴、德州驴、广灵驴、佳米驴、泌阳驴、淮阳驴、庆阳驴、华北驴、新疆驴、 西南驴等众多地方品种。由于驴的畜牧价值不断下降，而其经济价值却未见提高，驴的数量 在世界范围内急剧下降，驴皮的供应也逐年紧张，价格不断上涨。市场上出现了很多不法分 子，在生产阿胶时，部分甚至全部用各种其他动物皮包括马皮、牛皮、猪皮等，甚至脏皮、烂 皮、病死动物的皮等来取代驴皮进行熬制。这些伪品的存在严重干扰了市场正常秩序，损害 消费者利益，影响正规产品的信誉。
[0003] 胶类中药一般经长时间高温蒸煮浓缩而成，主要成分非常相近且不同厂家的生产 工艺存有差异，采用红外、近红外、X-衍射等方法对胶类中药纯品进行真伪鉴别常存在判断 不准确、缺乏足够说服力等。目前已报道的比较权威的方法主要是DNA分子鉴定方法和检 测特征性肽段的液质联用方法。DNA分子鉴定方法是鉴别动物DNA非常成熟的方法，但在胶 类的熬制过程中，DNA被严重破坏、降解，残存量极少，大大限制了该方法在胶类鉴别中的有 效应用。液质联用法测定蛋白质酶解肽的方法已经很成熟，只要找到动物源性成分稳定存 在的特征性多肽，便可用于检测；已报道的液质联用方法鉴别胶类中药的成分包括牛皮源 性成分、猪皮源性成分、龟源性成分、鹿源性成分等，虽有驴皮源性成分检测方法的报道，但 实为驴马共有成分，无法区分阿胶和马皮胶。目前仍没有用液质联用仪检测驴皮源性成分 的检测方法，这不但因为稳定存在的特征性多肽的寻找、鉴定及确认工作本身需付出大量 的努力，而且驴和马的亲缘关系非常近，它们在生物学本质上的差异也十分有限，因此很难 找到驴的特征性多肽用于驴皮源性成分的液质联用检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种驴特征性多肽以及 一种检测胶类中药中驴皮源性成分的方法，所述方法操作简单，特征性强，灵敏度高，能准 确鉴定胶类中药中是否含有驴皮源性成分。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0006] 本发明的一种驴特征性多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0007] 进一步的，本发明还提出了一种检测胶类中药中驴皮源性成分的方法，其特征在 于包括：将待检测的胶类中药样品用胰蛋白酶或精氨酸-C酶进行酶切后，取酶解溶液放入 液质联用仪，以待检测的胶类中药样品为基质，加入SEQ ID NO. 1所示的驴特征多肽或阿胶 纯品作为对照，采用二级质谱模式，选择三电荷母离子m/z690. 8及其子离子的离子对进行 监测；如果检测出该离子的保留时间与对照品一致，且其子离子与对照品的子离子一致，则 所述样品中含有驴皮源性成分。
[0008] 在本发明所述的方法中，优选的，所述胶类中药包括阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角 胶、狗骨胶以及海龙胶。
[0009] 在本发明所述的方法中，优选的，所述的酶切是按照以下方法进行：取0.05g待检 测的胶类中药样品于25ml量瓶中，加入少量1 % (w/w)NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解， 然后用1% (w/w)，pH8.0的NH4HOV^液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取滤液 100 μ 1加入2mg/ml的胰蛋白酶溶液10 μ 1，37°C恒温酶解12h。
[0010] 在本发明所述的方法中，优选的，液质联用仪检测的液相条件为：采用 2. ImmX 100mm，1.8 μπι C18反相色谱柱，流动相A为0· 1% (v/v)甲酸溶液，流动相B为乙腈， 流速0. 3ml/min ;梯度洗脱：0~40min，2%~50% B ;质谱条件为：电喷雾正离子模式进行 多反应监测，选择m/z690. 8 - 752. 4,809. 5,908. 5作为检测离子对进行MRM扫描。
[0011] 采用本发明的方法，能够快速检测胶类中药中是否含有驴皮源性成分，虽然该驴 特征多肽（SEQ ID NO. 1所示）的肽链中间含有精氨酸，但其特殊的空间结构，阻碍了胰蛋 白酶或精氨酸-C酶的酶切，从而保留了完整的肽链；尽管胶类中药中胶原蛋白多肽有一定 水解与破坏，但本发明基于其主要成分胶原蛋白中的差异性多肽，其含量高，采用液质联用 仪完全能够达到检测目的，不但能够将亲缘关系较近的驴源性成分和马种源性成分进行区 分，而且能对驴皮源性成分进行定量。
[0012] 本发明考察了大量的不同驴种的驴皮熬制成的胶，这些驴种包括关中驴、德州驴、 广灵驴、晋南驴、佳米驴、泌阳驴、淮阳驴、庆阳驴、华北驴、新疆驴、西南驴等；同时也考察 了大量的不同马种的马皮熬制成的胶，这些马种包括蒙古马、伊利马、西南马、云南马、百色 马、贵州马、三河马、巴里坤马等，证明本发明中的驴特征性多肽在各种驴皮及所熬制的胶 中均含有，而在各种马皮及所熬制的胶中均不含有，进一步证明了方法的可靠性。
【附图说明】
[0013] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中：
[0014] 图1是纯品胶MRM扫描模式下选择离子对m/z690. 8 - 752. 4,809. 5,908. 5监测 的质谱图；
[0015] 图2是加入5 %阿胶的混合胶MRM扫描模式下选择离子对m/z690. 8 - 752. 4， 809. 5,908. 5监测的质谱图。
【具体实施方式】
[0016] 以下将参照附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。
[0017] 实施例1各种纯品胶中驴特征性多肽的检测
[0018] I、材料和试剂
[0019] 材料：各种纯品胶类中药，包括阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶、鹿角胶、狗 骨胶、海龙胶，分别用驴皮、马皮、牛皮、猪皮、龟甲、鹿角、狗腿骨