一种测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学领域，尤其是一种测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析 方法。
【背景技术】
[0002] 代谢产物是在生命体内实现代谢过程的小分子有机化合物（分子量<1500Da)，是 在酶蛋白催化作用下，生成的基因表达的最终产物。代谢组学技术（metabo lomics)是后 基因时代发展起来的系统生物学的重要研究手段，旨在定量检测生物系统中尽可能多的代 谢产物。代谢组学技术被广泛应用到多个领域，比如疾病诊断、药品研发、营养食品评价、毒 理研究、环境监测、植物育种等。
[0003] 代谢组学技术根据是否预先设定检测的代谢物，分为非靶向代谢组学 (non-targeted metabo lomics)和革巴向代谢组学（targeted metabo lomics)。非革巴向代谢 组学预先不设定检测的化合物，而是对待侧样品中的所有代谢物的离子进行全扫描分析， 然后利用软件数据库对所扫描的化合物进行比对鉴定。非靶向代谢组学后期数据处理复 杂，耗时。尤其是代谢产物的鉴定，能准确鉴定出的生物体内代谢产物较少。靶向代谢组学 预先已知待检测的代谢产物的结构，理化性质。因此有效克服了传统的非靶向代谢组学的 缺点，简化了数据处理的过程，提高了分析结果的准确性，是近几年刚刚发展起来的新一代 代谢组学技术（next-generation metabo lomics) 〇
[0004] 靶向代谢组学的分析平台主要有基于核磁共振技术（NMR)和基于质谱（MS)及其 串联技术（MS/MS).与核磁共振技术相，MS/MS拥有更高的检测灵敏度和准确度。MS/MS根 据所连接的色谱仪又可以分为液相色谱串联质谱（LC-MS/MS)、气相色谱串联质谱（GC-MS/ MS)和毛细管电泳串联质谱（CE-MS/MS)。然而，GC-MS/MS只适合分析挥发性代谢产物，分 析非挥发性代谢产物需要进行繁琐的代谢物衍生化。CE-MS/MS仅适用于分析部分极性代谢 产物的。LC-MS/MS样品前处理简单，既能分析极性化合物，又能分析非极性化合物，可以最 大程度满足复杂样品中代谢产物的测定。然而传统的基于LC-MS/MS的靶向代谢组学方法 有一个很大的局限就是一次只能对少量代谢产物（〈50个）进行测定，与代谢组学分析尽可 能多的代谢产物的目标有很大的差距。另外，传统的代谢组学色谱分析时间都在60分钟以 上。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种测定生物体代谢产物的靶向代谢组学 分析方法。该方法对现有的靶向代谢组学方法进行了改进，是一种基于LC-MS/MS的同时测 定700种生物体内主要代谢产物的靶向代谢组学方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0007] -种测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，具体步骤如下：
[0008] (1)代谢产物特征母离子，碎片子离子的优化：将标准品溶解在甲醇或者水里， 配成0. 1-1μΜ的标准品溶液，运用三重四极杆质谱（MS/MS)，确定代谢产物的母离子，碎 片离子和质谱条件，包括解离电压（Declustering potential，DP)，轰击电压（Collision energy, CE)、碰撞口出口电压（Collision exit potential, CXP)和在色谱柱上的保留时 间；
[0009] (2)样品中代谢产物的提取：将样品与大肠杆菌-酵母菌13C稳定同位素内标 物按体积比10:1混匀，按混匀物与提取溶剂体积比1:4的比例加入提取溶剂甲醇-乙 腈-水并涡旋混匀，所述甲醇：乙腈：水的体积比40:40:20,在冰上静置10min，高速低温 (16000g，4°C )离心后，取上清得进样液；
[0010] ⑶LC色谱分离：采用氨基柱，通过亲水作用色谱（Hydrophilic interaction, HILIC)，对样品中的代谢产物进行分离；
[0011] (4)MS/MS检测方法建立：将优化好的代谢产物的特征母离子、碎片子离子、轰击 电压，碰撞口入口电压、轰击电压、碰撞口出口电压，保留时间信息输入到Analyst软件中， 将质谱正负离子极性转换时间设定为50ms，通过多反应检测模式（Scheduled MRM)对代谢 产物进行正负离子转换同时扫描，获得相应的色谱图；
[0012] (5)数据处理分析：通过Multiquant分析软件对MS/MS扫描所得色谱峰进行面积 积分，通过添加的内标化合物的峰面积，对各个样品进行归一化（Normalization)，利用偏 最小二乘分析（Partial least square analysis, PLS-DA)对各样品中的差异进行分型，通 过VIP (Variable influence on the projection)分析找出各组间有显著性差异的化合 物，进行代谢通路分析（Pathway enrichment analysis)。
[0013] 优选的，上述测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，所述步骤（2)中样 品为土壤、污水、食品、血液、细胞、动植物组织或微生物菌体。
[0014] 优选的，上述测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，所述步骤（3)中LC 的条件为：色谱柱Luna NH2 (250_X 2mm, 5 μ m，美国Phenomenex,公司），流动相A为95% 水+20mM氢氧化铵（NH40H) +15. 3mM甲酸（HC00H)，pH 9. 44 ;流动相B为100%的乙腈。
[0015] 优选的，上述测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，所述步骤（4)中 质谱的条件为：正负离子切换速率设定为50ms，停留时间设定为2ms ;负离子电压设定 为-4500V，正离子电压设定为5500V;离子源温度设定为500°C;Gas l，Gas 2,保护气 (Curtain gas)设定为30psi，辅助气I(Gasl)设定为35psi，辅助气2(Gas 2)设定为 35psi 〇
[0016] 优选的，上述测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，所述步骤（5)中对 所得的峰面积进行log 2转化，得转化后峰面积；计算各样品内标化合物转化后峰面积的 几何平均值；计算各样品的校正因子；利用校正因子对各个样品进行归一化；利用偏最小 二乘分析对各样品中的差异进行分型；通过VIP分析找出各组间具有显著性差异的化合 物；将有显著性差异的代谢产物，输入代谢通路分析软件进行代谢通路分析。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 上述测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，首先运用生物信息学的 方法，加上文献实证筛选了涵盖生物体内主要代谢途径的700种代谢产物，通过代谢产 物标准品确定了 700种代谢产物的特征母离子和碎片子离子，解离电压（Declustering potential，DP)，轰击电压（Collision energy, CE)和在色谱柱上的保留时间；样品中的代 谢产物在液相色谱上通过色谱柱在30分钟内实现了对代谢产物的色谱分离，然后代谢产 物被导入三重四极杆质谱仪（MS/MS)，通过多反应监测（Scheduled MRM)和正负离子极性 转换模式（Polarity switch)进行检测，与传统的代谢组学方法相比，该方法显著提高了代 谢组学的分析时间和代谢产物检测数量，具有检测化合物数量多、分析时间短、涵盖的代谢 通路全面的特点。
[0019] 利用本发明所述方法，一次进样在30分钟的时间内，可以同时测定700种代谢产 物，检测化合物的数量是目前传统靶向代谢组学方法的10倍以上；本发明所述方法采用了 正负离子转换同时扫描，使分析700个化合物的时间缩短至传统方法的1/4。此外，本发明 所测得化合物覆盖了生物体所有主要代谢途径，能够满足代谢组学分析的需求，并且还克 服了非靶向代谢组学数据处理复杂，重复性差、色谱峰鉴定困难的缺点。
【附图说明】
[0020] 图1 :新一代靶向代谢组学建立流程图；
[0021] 图2 :代表性色谱图和代谢产物；
[0022] 图3 :偏最小二乘分析（PLS-DA)分析重金属铅胁迫和对照组玉米根代谢差异；
[0023] 图 4 :VIP (Variable influence on the projection)分析显不重金属铅胁迫和对 照组玉米根具有显著性差异的代谢产物；
[0024] 图5 :代谢通路分析显示重金属铅胁迫对玉米根代谢的影响；
[0025] 图6 :利用新一代靶向代谢组学技术检测准确性考察；
[0026] 图7 :利用新一代靶向代谢组学技术分析的线性考察。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0028] 实施例1
[0029] 下述实施例1以玉米根为例，但本发明所述方法同样适用于食品、动物组织、土壤 样品等固体样品。
[0030] 基于LC-MS/MS同时测定玉米根部700种代谢产物的新一代靶向代谢组学分析方 法的建立
[0031] 新一代靶向代谢组学方法建立和应用的流程图见图1，【具体实施方式】如下：
[0032] (1)代谢产物特征母离子，碎片子离子的优化：将700个化合物的标准品，根据溶 解度分别溶解在甲醇或者水里，配成1 μΜ的溶液。取Iml溶液，通过注射器流动注射至三 重四极杆质谱中（ABSCI EX，Qtrap 5500);打开质谱工作站，通过Ql，MS2和MRM扫描确定代 谢产物的最佳母离子，碎片子离子、解离电压、轰击电压和碰撞口出口电压，选择Ql扫描信 号最强的离子为检测最佳母离子，MS 2扫描信号最强的离子为最佳碎片子离子，取最佳母离 子和子离子为多反应检测的离子对，通过MRM扫描，优化得到最强解离电压、轰击电压和碰 撞口出口电压，所优化的700种代谢产物的条件见表1。
[0033] 表1 LC-MS/MS同时测定70