0种代谢产物的优化值
[0034]
[0050] (2)玉米根中代谢产物的代谢产物的提取：取重金属铅胁迫和对照组玉米根 各50mg，液氮研磨后，加50 μ 1大肠杆菌-酵母菌13C稳定同位素内标化合物，混匀后，加 450 μ 1提取溶剂甲醇-乙腈-水（体积比40:40:20);祸旋混匀后，在冰上静置10分钟。 高速低温离心（16, 000g，4°C )后，取上清液得LC-MS/MS分析进样液。
[0051] (3)超高效液相色谱分离：通过自动进样器将10μ1分析进样液注入Luna NH2 色谱柱中（250mmX 2mm, 5 μ m，Phenomenex, CA)，通过亲水作用色谱，对样品中的代谢产物 进行分离；具体的色谱条件为：流动相A为95%水+20mM氢氧化铵（NH 40H)+15. 3mM甲酸 (HCOOH)，pH 9. 44 ;流动相B为100%的乙腈；流速为0. 3ml/min，柱温为25°C。梯度洗脱条 件为：〇_3min，95%B ;3· l-6min，80%B ;6· l-10min，70%B ;10-18min，2%B ;18-21min，0% B，21-27min 0% B ;28-31min，100% B ;31. lmin，95% B ;35min 停止。
[0052] (4)三重四极杆质谱扫描检测700个代谢产物：将优化好的700个代谢产物的 特征母离子、碎片子离子、轰击电压，碰撞口入口电压、轰击电压、碰撞口出口电压，保留时 间信息输入到质谱工作站Analyst软件中；采用正负离子快速切换的实时编程的多反应 检测模式进行扫描；正负离子切换速率设定为50ms，停留时间设定为2ms，负离子电压设 定为-4500V，正离子电压设定为5500V，离子源温度设定为500°C，Gas l，Gas 2,保护气 (Curtain gas)设定为30psi，辅助气l(Gas 1)设定为35psi，辅助气2(Gas 2)设定为 35psi。图2为代表性色谱图。
[0053] (5)样品数据分析：通过Mu11 i quant分析软件对MS/MS扫描所得色谱峰进行 积分，对所得的峰面积，进行log 2转化，得转化后峰面积，计算各样品内标化合物转化 后峰面积的几何平均值（Geomean)，计算各样品的校正因子（Normalization factor) 利用校正因子对各个样品进行归一化，利用偏最小二乘分析（Partial least square analysis，PLS_DA) (www.metaboana lyst. com)对各样品中的差异进行分型（图3)。通过 VIP(Variable influence on the projection)分析找出各组间具有显著性差异的化合物 (图4)。将有显著性差异的代谢产物，输入代谢通路分析软件（www. metaboana lyst. com)， 进行代谢通路分析（图5)。
[0054] 实施例2
[0055] 运用新一代靶向代谢组学分析方法测定血清中代谢产物的方法准确性考察（以 血清为例，适用于微生物菌液、尿液、污水等液体样品）
[0056] (1)代谢产物提取：取人血清样品95 μ 1，加入5 μ 1大肠杆菌-酵母菌13C稳定同 位素内标化合物，混匀后，加入400 μ 1提取溶剂（甲醇-乙腈-水40:40:20, v/v/ν)，涡旋 混匀后，在冰上静置10分钟。高速低温离心（16000g，4°C)后，取上清液得LC-MS/MS分析 进样液。取同样的血清，平行做10个重复样本。
[0057] (2)方法重现性考察：取10 μ 1血清提取物，运用上述建立的分析方法对10个样 本血清样品中的700种代谢产物进行测定。选择70个代表性色谱峰，计算10次测定的峰 面积的相对标准偏差（RSD)和保留时间的相对标准偏差（RSD)。如图6所示，在所选择的 70个代谢性色谱峰中，47% (33个）的峰其峰面积的RSD小于5%，25% (18个）的色谱峰 其峰面积的RSD值小于10%。所有70个色谱峰的保留时间的RSD都小于5%。这表明方 法的重现性良好。
[0058] (3)方法线性考察：取血清，0.9%的生理盐水，分别稀释2、4、8、16和32倍。取 100 μ 1稀释的血清，加入400 μ 1提取溶剂甲醇-乙腈-水（40:40:20, v/v/ν)，按上述方 法，对代谢产物进行提取和色谱分析。将浓度和所得峰面积做相关性分析，以回归系数（r2) 来评价质谱响应与血清浓度的线性关系。如图7所示，70%的色谱峰其质谱峰面积和浓度 的回归系数大于〇. 99,20%的色谱峰的峰面积和浓度的回归系数大于0. 98。从这些数据可 以看出本发明方法准确性更好、线性范围更宽。
[0059] 由实施例1和2可以看出，本发明公开的一种基于LC-MS/MS同时测定700种代谢 产物的新一代靶向代谢组学分析方法，通过优化代谢产物的母离子，子离子和色谱分离条 件，采用正负离子快速切换的实时编程的多反应检测模式，30分钟内实现了对覆盖生物体 所有主要代谢途径的700个代谢产物进行了同时测定。所获的色谱图，通过定量分析软件 进行积分得峰面积。所得的峰面积通过内标化合物进行归一化，然后通过统计学分析和代 谢通路分析比较各组样品之间的差异，建立新一代靶向代谢组学方法。
[0060] 与传统的靶向代谢组学不同，本发明方法比传统的靶向代谢组学方法检测化合物 的数量更多，分析时间更短，所覆盖的代谢途径更广，能够满足代谢组学分析的需求。此外， 本发明还克服了非靶向代谢组学数据处理复杂，重复性差、色谱峰鉴定困难的缺点。
[0061] 上述参照实施例对该一种测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法进行的 详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不 脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，其特征在于：具体步骤如下： (1) 代谢产物特征母离子，碎片子离子的优化：将标准品溶解在甲醇或者水里，配成 0. 1-1μΜ的标准品溶液，运用三重四极杆质谱，确定代谢产物的母离子，碎片离子和质谱条 件，包括解离电压、轰击电压、碰撞口出口电压和在色谱柱上的保留时间； (2) 样品中代谢产物的提取：将样品与大肠杆菌-酵母菌13C稳定同位素内标物按体积 比10:1混匀，按混匀物与提取溶剂体积比1:4的比例加入提取溶剂甲醇-乙腈-水并涡旋 混匀，所述甲醇：乙腈：水的体积比40:40:20,在冰上静置lOmin，高速低温离心后，取上清 得进样液； (3) LC色谱分离：采用氨基柱，通过亲水作用色谱，对样品中的代谢产物进行分离； (4)MS/MS检测方法建立：将优化好的代谢产物的特征母离子、碎片子离子、轰击电压， 碰撞口入口电压、轰击电压、碰撞口出口电压，保留时间信息输入到Analyst软件中，将质 谱正负离子极性转换时间设定为50ms，通过多反应检测模式对代谢产物进行正负离子转换 同时扫描，获得相应的色谱图； (5)数据处理分析：通过Multiquant分析软件对MS/MS扫描所得色谱峰进行面积积 分，通过添加的内标化合物的峰面积，对各个样品进行归一化，利用偏最小二乘分析对各样 品中的差异进行分型，通过VIP分析找出各组间有显著性差异的化合物，进行代谢通路分 析。2. 根据权利要求1所述的测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，其特征在 于：所述步骤（2)中样品为土壤、污水、食品、血液、细胞、动植物组织或微生物菌体。3. 根据权利要求1所述的测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，其特征在 于：所述步骤⑶中LC的条件为：色谱柱LunaNH2250mmX2mm，5μπι，流动相A为95%水 +20mM氢氧化铵+15. 3mM甲酸，pH9. 44 ;流动相B为100%的乙腈。4. 根据权利要求1所述的测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，其特征在 于：所述步骤（4)中质谱的条件为：正负离子切换速率设定为50ms，停留时间设定为2ms ; 负离子电压设定为-4500V，正离子电压设定为5500V ;离子源温度设定为500°C ;保护气设 定为30psi，第一辅助气设定为35psi，第二辅助气设定为35psi。5. 根据权利要求1所述的测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，其特征在 于：所述步骤（5)中对所得的峰面积进行log2转化，得转化后峰面积；计算各样品内标化 合物转化后峰面积的几何平均值；计算各样品的校正因子；利用校正因子对各个样品进行 归一化；利用偏最小二乘分析对各样品中的差异进行分型；通过VIP分析找出各组间具有 显著性差异的化合物；将有显著性差异的代谢产物，输入代谢通路分析软件进行代谢通路 分析。
【专利摘要】本发明提供了一种测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法，基于超高效液相色谱串联三重四级杆质谱同时测定700种生物体主要代谢产物，该方法首先筛选了700种生物体内主要代谢产物，采用这些化合物的标准品优化获得了代谢产物的最佳母离子，子离子和质谱分析条件，利用甲醇-乙腈-水提取样品中的代谢产物，通过优化液相色谱条件，采用亲水作用色谱，对代谢产物进行分离，分离后的代谢产物进入质谱中，采用正负极快速转换的实时编程的多反应检测模式对700种代谢产物进行同时测定，通过偏最小二乘分析对各样品间代谢产物的差异进行分析，利用代谢通路分析找出代谢途径的变化，显著提高了检测化合物数量，大幅度缩短了分析的时间。
【IPC分类】G01N30/88, G01N27/62
【公开号】CN105301163
【申请号】CN201510853787
【发明人】李克峰, 王旭
【申请人】天津桑尼匹克生物科技有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月27日