醇溶解后，加流动相稀释制成每lmL中约含0.5mg的 溶液，作为供试品溶液。另取杂质A、杂质B适量，加流动相溶解并稀释，配制杂质对照品溶 液。分别精密取上述杂质对照品溶液、供试品溶液及溶剂各20yL，注入液相色谱仪，记录色 谱图。结果如图1~4所示。
[0134] 结果表明，在本发明检测方法的条件下，替格瑞洛原料M3样品及样品中其余杂质 对杂质A、杂质B的测定无干扰，证明本发明检测方法的专属性强。
[0135] 3、标准曲线和线性范围
[0136] 精密量取杂质A、杂质B对照品溶液适量，用流动相稀释制成一系列浓度的对照品 溶液。分别精密取不同浓度的对照品溶液各20yL，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别测定 峰面积，结果见表1。
[0137] 表1、线性关系 [01381
[0139] 以杂质对照品溶液的浓度为横坐标X，以其峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算 杂质的线性回归方程及相关系数r，标准曲线如图18~19所示。
[0140] 结果表明，本发明检测方法中杂质A的浓度在0.1218yg/mL~2.436yg/mL范围内与 峰面积呈良好的线性关系，线性方程:Y= 19909.3027X+1646.1472，r = 0.9997;杂质B的浓 度在0. 1268yg/mL~2.536g/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y = 21668.9382Χ+1651.6059，r = 0.9995;证明本发明方法线性范围广，准确度高。
[0141] 此外，从标准曲线方程和图可以看出，斜率远远大于截距，标准曲线接近原点，说 明各杂质的含量测定适合于本发明的外标一点法。
[0142] 4、精密度试验
[0143] 取试验例1第3项下的混合杂质对照品溶液3#，精密取20yL，注入高效液相色谱仪， 连续进样6次，按照本发明的检测方法分别测定峰面积，结果见表2。
[0144] 表2、精密度试验结果
[0145]
[0147] 计算得到杂质A峰面积的RSD为:2.79%，杂质B峰面积的RSD为2.82%，证明本发明 的检测方法精密度优异。
[0148] 5、定量限
[0149] 量取试验例第3项下混合杂质对照品溶液5#，精密量取20μ1，注入液相色谱仪，按 照本发明的检测方法测定峰面积及基线噪音，结果见表3。
[0150]表3、定量限试验结果
[0151] ___
[0152] 杂质A、杂质B和杂质C的峰高均约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N=10计，得杂质 A的定量限为2.436ng，杂质B的定量限为2.536ng，证明本发明方法的检测灵敏度高，可以充 分满足杂质定量测定的要求。
[0153] 6、重复性试验
[0154] 精密称取替格瑞洛原料M3样品6份，各约1 Omg，分别置20mL量瓶中，加溶剂溶解并 稀释至刻度，得供试品溶液。精密量取上述6份供试品溶液各20yL，按照本发明的检测方法 进行检测，按外标法以峰面积计算杂质A和杂质B的含量，结果见表4。
[0155] 表4、重复性试验结果
[0156]
[0157] 由上述结果可知，本发明检测方法的重复性良好。
[0158] 7、溶液稳定性试验
[0159] 精密称取替格瑞洛原料M3约10mg，置20mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供 试品溶液。分别于配制后〇11、11 1、211、411、611、811进样2(^1^，记录色谱图，考察其供试品溶液中 杂质A、杂质B和杂质C的稳定性情况，结果见表5。
[0160] 表5、供试品溶液稳定性试验结果表
[0161]
12345 由上述结果可知，在配制后8小时内供试品溶液中杂质A、杂质B均未检出，证明本 发明检查方法供试品溶液稳定。 2 8、回收率试验 3 精密称取替格瑞洛原料M3样品9份，各约10mg，分别置20mL量瓶中，加入试验例第3 项下各杂质浓度约为20yg/mL的对照品溶液0.8mL、1. OmL、1.2mL各3份，加溶剂溶解并稀释 至刻度，摇匀，分别作为回收率供试品溶液。分别精密取9份回收率供试品溶液及试验例第4 项下的对照品溶液各20yL进样测定，记录色谱图，计算杂质A和杂质B杂质C的测得量、对照 品加入量及回收率，结果见表6~8。 4 计算公式： c-a 5 回收率％= - xlOO% b
[0167] 式中:a为供试品中所含异构体杂质的量(yg);
[0168] b为异构体杂质对照品加入量(yg);
[0169] c为异构体杂质的测得量(yg)。
[0170] 表6、杂质A回收率试验结果
[0171]
[0172] 结果表明，本发明检测方法测定替格瑞洛原料M3中的手性异构体杂质A，回收率在 98.3 %~105.2 %之间，相对标准偏差为2.28 %，证明本发明的检测方法回收率好，准确度 尚。
[0173] 表7、杂质B回收率试验结果
[0174]
[0176]结果表明，本发明检测方法测定替格瑞洛原料M3中的手性异构体杂质B，回收率在 95.7 %~103.0 %之间，相对标准偏差为2.60 %，证明本发明的检测方法回收率好，准确度 尚。
[0177]综上所述，本发明提供了一种式I所示化合物中异构体杂质含量的检测方法，式I 所示化合物色谱峰与异构体色谱峰之间的分离度高；而且，操作简便，容易控制，检测成本 低，并具有良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，加样回收率高，检测 结果准确、可靠，为监控式I所示化合物的产品质量提供了一种行之有效的检测方法，并进 一步保证了替格瑞洛的产品质量和患者的用药安全。
【主权项】
1. 一种式I所示化合物中异构体杂质含量的检测方法，其特征在于:它包括W下步骤：a、 取式I所示化合物的异构体，制备对照品溶液； b、 取待检的式I所示化合物，制备供试品溶液； C、采用高效液相色谱方法分别对对照品溶液、供试品溶液进行检测，所述高效液相色 谱方法的检测条件为： 色谱柱：固定相为直链淀粉-=(3，5-二甲苯基氨基甲酸醋）； 流动相:正己烧-乙醇-异丙醇，正己烧、乙醇、异丙醇的体积比为90% : 5% : 5% ; 检测波长:200nm~300nm; d、按外标法W峰面积计算，或者根据峰面积与浓度之间的标准曲线计算，得到式I所示 化合物中的异构体杂质含量。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的异构体杂质至少包括2-{((3aS,4R,6S,6aR) )-6-[7-( (1S, 2R)-2-(3,4-二氣苯基）环丙胺基）-5-丙硫基-3H-[ 1,2, 3]^氮挫[4,5-(1]喀晚-3-基]-2,2-二甲基-四氨-环戊并-1，3-二恶茂-4-氧基}乙醇、2-{((3aS ,4R, 6S ,6aR) )-6-[7-( (IR, 2S)-2-(3,4-二氣苯基）环丙胺基）-5-丙硫基-3H-[ 1,2, 3]S氮挫[4,5-d]喀晚-3-基]-2,2-二甲基-四氨-环戊并-1,3-二恶茂-4-氧基}乙醇中的一 种。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的异构体杂质同时包括2-{((3aS,4R,6S,6aR) )-6-[7-( (1S, 2R)-2-(3,4-二氣苯基）环丙胺基）-5-丙硫基-3H-[ 1,2, 3]S氮挫[4,5-d]喀晚-3-基]-2,2-二甲基-四氨-环戊并-1,3-二恶茂-4-氧基}乙醇和2-{((3aS ,4R, 6S ,6aR) )-6-[7-( (IR, 2S)-2-(3,4-二氣苯基）环丙胺基）-5-丙硫基-3H-[ 1,2, 3]S氮挫[4,5-d]喀晚-3-基]-2,2-二甲基-四氨-环戊并-1,3-二恶茂-4-氧基}乙醇。4. 根据权利要求1~3任意一项所述的检测方法，其特征在于:步骤a中，制备对照品溶 液的溶剂为步骤C中的流动相;步骤b中，制备供试品溶液的溶剂为步骤C中的流动相。5. 根据权利要求1~3任意一项所述的检测方法，其特征在于:步骤C中，所述的色谱柱 为 CHi民ALPAK'、AD-H。6. 根据权利要求1~3任意一项所述的检测方法，其特征在于:步骤C中，色谱柱的长度 为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为如m。7. 根据权利要求1~3任意一项所述的检测方法，其特征在于:步骤C中，色谱柱的柱溫 为25°C~40°C;优选的，色谱柱的柱溫为30°C。8. 根据权利要求1~3任意一项所述的检测方法，其特征在于:步骤C中，所述流动相的 流速为〇.9ml/min~1. Iml/min;优选的，所述流动相的流速为1 .Oml/min。9. 根据权利要求1~3任意一项所述的检测方法，其特征在于:步骤C中，所述的检测波 长为200nm~300nm;优选的，所述的检测波长为254nm。10. 根据权利要求1~3任意一项所述的检测方法，其特征在于:步骤C中，进样体积为10 Jil~50]il;优选的，进样体积为20]il。
【专利摘要】本发明公开了一种式Ⅰ所示化合物中异构体杂质含量的检测方法，它包括以下步骤：a、制备对照品溶液；b、制备供试品溶液；c、采用高效液相色谱方法分别对对照品溶液、供试品溶液进行检测；d、按外标法以峰面积计算，或者根据峰面积与浓度之间的标准曲线计算，得到式Ⅰ所示化合物中的异构体杂质含量。本发明提供了一种式Ⅰ所示化合物中异构体杂质含量的检测方法，式Ⅰ所示化合物色谱峰与异构体色谱峰之间的分离度高；而且，操作简便，容易控制，检测成本低，检测结果准确、可靠，为监控式Ⅰ所示化合物的产品质量提供了一种行之有效的检测方法，并进一步保证了替格瑞洛的产品质量和患者的用药安全。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105510482
【申请号】CN201610064894
【发明人】刘霞, 林正茂
【申请人】成都百裕制药股份有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月29日