，底物液A为含有
0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为2 mol/L的硫酸，浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1 mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
[0021]基于上述制备的试剂，本发明用于检测草甘磷的酶联免疫试剂盒包括如下材料:
(1)96孔酶标板Xl块；
(2)标准液X6 瓶:(lmL/ 并瓦)O mg/kg、0.lmg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg ；
(3)抗体工作液7 mL ；
(4)酶标二抗工作液7 mL ；
(5)底物液A7 mL ；
(6)底物液B7 mL ；
(7)终止液7 mL ；
(8)10X浓缩稀释液 40 mL;
(9)10X浓缩洗涤液 40 mL;
本发明的试剂盒用于检测谷物样本中草甘磷残留量时，通过以下步骤实施:样品预处理、用本发明试剂盒进行检测、分析结果。
[0022](I)样品预处理
a、研磨代表性样品(使50%的样品可以通过一个20目的滤网)；
b、称量15g研磨过滤后的样品加入30 mL水；
C、在密封的容器里混合，震荡涡旋I min;
d、室温离心4000r/min以上，1min；
e、、取1ml上清液到离心管中，加入1mL二氯甲烷，在密封的容器里混合，震荡涡旋Imin,室温离心 4000r/min 以上，1min ；
f、取ImL上清液，加入ImL稀释后的样品稀释液充分振荡混合30 S，混匀待测。
[0023](2)用本发明试剂盒检测待测样品中草甘磷残留量
取包被有草甘磷抗原的酶标板，加标准品/样本50 μ?7孔到对应的微孔中；加入酶标二抗工作液，50 μ?7孔，然后加入草甘磷抗体工作液，50 μ?7孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min;小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300 μ?/孔，充分洗涤4次，浸泡15-30 S，用吸水纸拍干；加入底物液A 50 μ?/孔，底物液B 50 μ?ν孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15 min ;加入终止液50 VL/孔,轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测,测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据);对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中草甘磷残留量。
[0024](3)分析结果
百分吸光度值的计算，标准品或样本的百分吸光度值等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(%) = B/B0X100%
其中B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0-O ppb标准溶液的平均吸光度值。
[0025]以草甘磷的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中草甘磷的实际浓度。
【主权项】
1.检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括酶标板、草甘磷标准品、草甘磷抗体工作液、草甘磷酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。2.检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括以下步骤:酶标板的制备、草甘磷标准品的制备、草甘磷抗体工作液的制备、草甘磷酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。3.根据权利要求2所述的检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于:所述的酶标板制备方法为将草甘磷半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到草甘磷包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释成1:40000比例，100h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150 μ L/孔，371:放置1.5 h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4°C条件下保存。4.根据权利要求2所述的检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于:草甘磷标准品的浓度分别为 O mg/kg、0.lmg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。5.根据权利要求2所述的检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于:所述的草甘磷抗体工作液是采用草甘磷人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1:60000比例制备。6.根据权利要求2所述的一种检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于:所述的草甘磷酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1:2000比例，所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2 mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，其为0.1 mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其为含 0.5% 吐温-20，0.01 mol/L 的 PBST，pH 值范围 7.0-7.5 之间。7.权利要求2所述的检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法的特征在于:预处理待测样品，取包被有草甘磷抗原的酶标板，按序分别加入标准品/样本、草甘磷酶标二抗工作液、草甘磷抗体工作液各50 μ L/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°c避光环境中反应30 min,将孔内液体甩干，用洗涤工作液充分洗涤4飞次，每次间隔10 S，拍干后加入底物液A 50μ L/孔,底物液B 50 μ L/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15?20 min,加入终止液50 μ L/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)，以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中草甘磷的含量。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述待测样品用以下方法进行预处理: a、研磨代表性样品(使50%的样品可以通过一个20目的滤网)； b、称量15g研磨过滤后的样品加入30 mL水； C、在密封的容器里混合，震荡涡旋I min ； d、室温离心4000r/min以上，1min ； e.、取1ml上清液到离心管中，加入1mL二氯甲烷，在密封的容器里混合，震荡涡旋Imin,室温离心 4000r/min 以上，1min ； f、取ImL上清液，加入ImL稀释后的样品稀释液充分振荡混合30 S，混匀待测。
【专利摘要】本发明为检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被草甘磷抗原的酶标板、草甘磷标准品、草甘磷抗体工作液、草甘磷酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。检测草甘磷的酶联免疫试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标板微孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下显色剂呈现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中草甘磷的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测谷物中草甘磷的残留量。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105510588
【申请号】CN201410548726
【发明人】洪霞, 戴蔚蔚, 张淑雅
【申请人】镇江亿特生物科技发展有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年10月16日