抑制素b的酶联免疫检测试剂盒及抑制素b测试方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测试剂盒技术领域，特别设及一种抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒 及抑制素 B测试方法。
【背景技术】
[0002] 抑制素 B是由生殖系统细胞分泌产生，与生殖能力有密切关系，对生殖功能具有内 分泌、旁分泌和自分泌的调节作用。目前已经证实抑制素 B是卵巢储备功能和睾丸曲细精管 功能的主要标记物，可W用于卵巢因素引起的女性不孕和曲细精管功能障碍引起的男性不 育检测。
[0003] 目前，抑制素 B的检测采用常规酶联免疫方法化LISA)，具体操为:首先，向样本中 添加预先包被的微孔板，进行解育后，经多次洗涂，再加入二抗酶标及显色系统，通过酶标 仪读取OD值，W判定样品中抑制素 B的浓度。然而采用常规的酶联免疫方法检测抑制素 B，由 于耗时较长、检测线性狭窄，灵敏度低、抗干扰能力弱，不利于在临床医疗机构中使用。
【发明内容】
[0004] 本发明实施例的目的在于，提供一种抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒及抑制素 B测 试方法，W克服现有测试抑制素 B方法存在的耗时较长、检测线性狭窄，灵敏度低、抗干扰能 力弱等的不足。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0006] -种抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:包括包被有抗抑制素 B抗体的 酶标板、生物素标记二抗、亲和素标记酶标;其中，制备所述包被有抗抑制素 B抗体的酶标板 所用的包被原是针对抑制剂邮亚单位特异性抗体，所述生物素标记二抗为生物素标记抑制 素 Ba亚单位单克隆抗体。
[0007] W及，一种检测抑制素 B的方法，包括采用本发明抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒 对待测样品检测的步骤。
[0008] 上述本发明抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒含有针对抑制剂邮亚单位特异性抗体 包被原的酶标板和生物素标记抑制素 Ba亚单位单克隆抗体，使得因此，本发明抑制素 B的酶 联免疫检测试剂盒特异性强、能准确灵敏地检测体液中抑制素 B含量，如最低检测限能达到 Wng/L，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，本发明对解决大批量样 品的抑制素 B检测技术具有重要的现实意义。
[0009] 进一步地，所述生物素标记抑制素 Ba亚单位单克隆抗体中的抑制素 Ba亚单位单克 隆抗体通过由半抗原人工重组抑制素 Ba亚单位肤段与载体蛋白偶联成免疫经体内免疫反 应制备获得，提高了本发明抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒特异性强、能准确灵敏地检测体 液中抑制素 B含量。
[0010] 上述本发明检测抑制素 B的方法是直接采用上述本发明抑制素 B的酶联免疫检测 试剂盒进行检测抑制素 B，因此，本发明检测抑制素 B的方法灵敏高，特异性和抗干扰能力 强，能快速同时检测大量的样品。
【附图说明】
[0011]下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[001^ 图巧本发明抑审朦B的标准曲线示意图。
【具体实施方式】
[0013] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0014] 本发明实施例提供了具有灵敏度高、特异性强、省时的酶联免疫检测试剂盒，用于 抑制素 B的检测。
[001引在一实施例中，该抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒包括包被有抗抑制素 B抗体的酶 标板、生物素标记二抗、亲和素标记酶标。
[0016] 运样，本发明实施例抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒中的酶标板上的每个孔均包 被有相同量的抗体，加入待测抑制素 B样品，固相包被抗体和待测抑制素 B反应，所W当待测 的抑制素 B浓度高时，则被结合在固相抗体上抑制素 B多，加入的生物素标记二抗及亲和素 标记酶标与被固定抑制素 B结合量多，用洗涂液洗涂后加入底物液（显色液），显色反应深， 用酶标仪检测的OD值高;反之，当待测抑制素 B浓度低时，则所测的OD值低。根据用已知的抑 制素 B浓度检测所作的标准曲线，可W推算出待测抑制素 B的浓度。
[0017] 因此，在一实施例中，本发明实施例抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒中的包被有抗 抑制素 B抗体的酶标板的制备过程中，所用的包被原是针对抑制素邮亚单位单克隆抗体，所 用包被液是碳酸钢缓冲液，所用封闭液是含明胶的该包被液。在进一步实施例中，碳酸钢缓 冲液的浓度为1 % (w/v)~3% (w/v)。在另一实施例中，在该封闭液中，明胶含量为0.5% (v/ V)~5%(v/v)，优选为1%。
[0018] 另外，包被有抗抑制素 B抗体的酶标板的制备方法可W按照常规的包被抗体的酶 标板的制备方法。
[0019] 在另一实施例中，所述生物素标记二抗为生物素标记抑制素 Ba亚单位单克隆抗 体。
[0020] 在进一步实施例中，所述生物素标记抑制素 Ba亚单位单克隆抗体中的抑制素 Ba亚 单位单克隆抗体是由半抗原人工重组抑制素 Ba亚单位肤段与载体蛋白偶联成免疫原，再将 体内免疫反应和细胞培养、纯化获得。所述生物素标记抑制素 Ba亚单位单克隆抗体由该方 法获得，提高了本发明抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒特异性强、能准确灵敏地检测体液中 抑制素 B含量。
[0021] 在一优选实施例中，半抗原人工重组抑制素 Ba亚单位肤段是由下述方法制备获 得：
[0022] 步骤SOI:根据抑制素 B编码基因 INHBA，设计优势序列，进行原核表达，PCR筛选阳 性克隆；
[0023] 步骤S02:将所述阳性克隆转入E.coli BL21 (DE3)进行培养至0D600 = 0.4-0.6，加 诱导剂IPTG诱导表达处理，离屯、收集菌体；
[0024] 步骤S03:将收集的所述菌体破碎处理，并分离纯化处理，得到所述半抗原人工重 组抑制素 Ba亚单位肤段。
[0025] 其中，上述步骤SOl中的抑制素 B编码基因 INHBA是从GeneBank检索的抑制素 B编码 基因 INHBA。该抑制素 B编码基因 INHBA如下沈QID NO: 1所示：
[0027] 上述沈QID N0:1所述的序列公用数据库可查，如GenBa址:BT006954.1。
[0028] 该步骤SOl中设计优势序列如SEQID NO:2所示：
[0032] 该步骤SOl中的原核表达是将设计优势序列转入T载体，PET-24b原核表达。
[0033] 上述步骤S02中的将所述阳性克隆转入E.coli BL2UDE3)进行培养方法是将带有 正确表位的阳性克隆转入E.coli化21(DE3)，LB培养基培养，37°C震荡（150巧m)培养至 00600 = 0.4-0.6。
[0034] 该步骤S02中加的诱导剂为IPTG至终浓度ImM。诱导表达处理的条件可W是在30°C 诱导表达6小时。
[0035] 上述步骤S03中的体破碎处理方法是将离屯、收集菌体用抑7.4的PB重悬菌体，超声 波破碎菌体，离屯、分离上清。
[0036] 该步骤S03中的分离纯化处理是将分离的上清液进行SDS-PAGE胶分析，收集分子 量约15.5邸、14KD处的蛋白带，采用NI亲和纯化目的蛋白，即得到半抗原人工重组抑制素 Ba 亚单位肤段。在一实施例中，由半抗原人工重组抑制素 Ba亚单位肤段与载体蛋白偶联成免 疫原中的载体蛋白选用牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白（OVA)或匙孔血蓝蛋白化LH)中的至 少一种。该些载体蛋白能有效与半抗原人工重组抑制素 Ba亚单位肤段进行偶联反应生成免 疫原。另外，该半抗原人工重组抑制素 Ba亚单位肤段与载体蛋白的偶联反应方法可W按照 常规的制备免疫原的方法进行。
[0037] 在一实施例中，上述抑制素 B的酶联免疫检测试剂盒实施例中的生物素标记二抗 即生物素标记抑制素 Ba亚单位单克隆抗体中的生物素标记物选用酷-N径基下二酷亚胺醋 (BNHS)、酷阱(BHZ)和阱化生物胞素(BC监）、3-(N-马来酷亚胺-丙酷)-生物胞素(MPB)中的 至少一种