侧向散射和荧光发射由透 镜16收集并且使用反射镜44朝向探测器阵列46反射。反射镜44优选地反射100%的光，但是 定位为使得仅反射来自于来自激光器40的光束与流动流的交叉部的发射。来自于光谱扫描 探测区域的光不遇到反射镜，并且由光电探测器20探测。可选择地，反射镜44可以是反射给 定波长范围的光的分光反射镜。
[0081] 探测器阵列46包括一个或多个分离探测器，其能够探测侧向散射光和/或荧光发 射。例如，在优选的实施例中，探测器阵列46包括在美国专利No. 7，129，505和6，683，314中 描述的探测光学器件，通过引用将其全部结合在这里。
[0082]探测器阵列46被构造为使用探测器通道来测量发射，这些探测器通道是彼此不同 的、与由白光激光器提供的频率的范围部分重叠的或者重叠的。因为两个激发/探测器系统 是空间分离的，所以他们是基本独立的。因此，一般来说，本发明的光谱扫描可以与典型的 流动血细胞计数器中标准激发和探测光学器件一同实施，典型的流动血细胞计数器可以包 括多个激发激光器和多个探测器阵列。
[0083]触发器被用来对粒子进入探测区域进行计时。优选地，触发是基于散射参数（例 如，前向散射），但是在实践中，在探测区域上游的任何可区别的信号都适合于进行触发。 [0084]声光可调谐滤波器(A0TF)30定位在激光器10与棱镜12之间的激发束的路径上。 A0TF 30可操作地连接到控制器3240TF 30是通带滤波器，其可以在由控制器32施加到 A0TF的RF频率的控制下选择并传送来自于入射光的波长的所选择的窄波段。为了简化解 释，A0TF可以被描述为选择具体波长，但是将会明白A0TF实际选择波长的窄波段。控制器32 被构造为向A0TF提供可变RF频率，由此控制所选择的波长。
[0085]色散的激发束被过滤为波长的窄波段的宽度对应于色散的、全光谱激发束的宽度 的一部分。因此，在波长的给定所选择窄波段处，仅在探测区域内的一小点被照明，并且该 点的位置由棱镜色散的角度来确定。因为每个波长都由棱镜在不同角度色散，所以将波长 的所选择的窄波段从光谱的一端改变到另一位置导致将被照明的点从探测区域的一端伴 随着移动到另一位置。控制器32被构造为与粒子穿过流动通道的移动同步地改变由AOTF选 择的波长的窄波段，使得粒子在穿过探测区域的同时被连续地照明，尽管激发光具有持续 改变的波长。
[0086]为了将由A0TF选择的波长的改变与粒子穿过流动通道的移动同步，波长选择必须 与粒子进入探测区域同步，并且波长选择的改变速率必须与粒子穿过探测区域的速率同 步。粒子进入探测区域从触发器信号(例如，前向散射)开始计时，触发器信号是从粒子穿过 在紧接在探测区域的上游的触发器激光束而获得的。触发器信号被从探测器47或46(取决 于探测器46和47中哪一者用作触发器信号）发送到控制器32,控制器32开始扫过RF信号并 控制A0TF扫过所选择的波长。
[0087]从探测到触发到开始光谱扫描的时间取决于流速以及从触发探测区域到光谱扫 描探测区域的距离。在实践中，系统可以被经验地校准。
[0088]控制器32被构造为改变由A0TF选择的波长，使得探测区域内的被照明的点以与粒 子相同的速率移动。粒子的速率（即，流动流穿过小管2的速率)是与仪器相关的，并且可以 使用流动血细胞计数器的领域中标准的方法来经验地确定。
[0089]图 4A-图 4D
[0090]图4A-图4D描绘了使用图3的系统来扫描粒子的激发光谱。如图所示，粒子1在其穿 过小管2中的流动通道时的方向是从图的底部到顶部。已经由棱镜色散为颜色的光谱的激 发束与流动通道在被称作为探测区域的通道长度上交叉。为了示意性目的，激发光束被示 出为扩展到从蓝光到红光的光谱范围。波长的实际范围将取决于由激发源发射的波长的范 围。为了有助于描述，表现出了激发束内的四个离散颜色，但是激发束实际上可以从其光谱 在光束底部极限处的蓝色末端连续地改变到其光谱在光束顶部极限处的红色末端。因此， 粒子1在其穿过流动通道的探测区域时被暴露到从蓝色到红色的激发光的整个光谱。
[0091] 图4A描绘了由前向探测器47检测粒子。由前向散射探测器检测粒子提供表示粒子 1将会进入光谱扫描探测区域的触发。
[0092] 图4B描绘了荧光粒子的光谱扫描的起点。粒子刚刚进入探测区域并且暴露到在激 发束的光谱的蓝色末端中的光的波长。全部激发束由声光可调谐滤波器(A0TF)30过滤，以 在全部激发束的光谱中的最短波长(大值蓝色)处提供激发光的窄波段。经过滤的激发束的 窄波段被描绘为虚线之间的阴影区域。因为激发束光谱的蓝色端被色散到最大的角度，并 且形成探测区域的极限，所以窄波段与流动流在探测区域的起点处交叉。
[0093]图4C描绘了光谱扫描的中间阶段。粒子已经移动通过探测区域的中途，使其定位 在探测区域中处于黄色和绿色之间波长的光与流动流交叉的位置处。由A0TF选择的波长的 窄波段已经与粒子移动同步地改变，使得粒子被该窄波段内的波长照射，并且激发束的全 光谱内的其他波长已经被过滤掉。
[0094]图4D描绘了光谱扫描的结束。粒子已经移动为使其将要离开激发束。此时，粒子定 位在探测区域中大约红色的光的波长与流动流交叉的位置。由A0TF选择的波长的窄波段已 经与粒子移动同步地改变，使得粒子被该窄波段内的波长照射，并且激发束的全光谱内的 其他波长已经被过滤掉。
[0095]因此，如上所述，随着粒子移动通过探测区域，通过连续地改变具有波长的窄波段 的激发束来激发该粒子。窄激发束跟踪粒子通过探测区域。激发束的物理移动是由棱镜的 与波长有关的色散以及由AOTF连续地改变的波长选择而导致的。
[0096] 随着粒子行进通过探测区域并且由连续改变的激发束波长激发，来自粒子的荧光 发射(在探测波长的静态波段中测量的）由透镜16收集，并且被朝向光电探测器20引导(这 两个要素都在图3中示出）。所产生的数据提供了粒子的激发光谱在激发束的波长范围上的 测量结果。
[0097] 图5
[0098] 图5描绘了本发明的一个实施例的激发束光谱和探测器通道，连同示例性荧光粒 子(在这里被称作为FP1)的激发和发射光谱。FP1的激发光谱510和发射光谱520仅为了示意 性目的而示出，以帮助于理解本发明，并且不意图表示任何具体荧光染料的光谱。X轴是波 长，并且y轴是用于示意性说明标准化光谱的任意刻度。在该示例中，荧光粒子表现在约 550nm处的激发峰和在约625nm处的发射峰(具有75nm的斯托克斯频移）。
[0099] 激发束光谱的极限（由激发源发射的波长的范围）和探测通道的极限（用于探测粒 子荧光的波长的范围）被示意性地示出为沿着X轴的条。在该示例中，假设激发束的光谱的 范围从450到600nm，其对应于从蓝色到橘红色的颜色的范围（见以上的表格）。由长通滤波 器(例如，图1和图3中示出的滤波器18)的透射范围限定的探测器通道探测比约630nm更长 的波长的发射。
[0100] 如可以从图5看到的，探测器通道测量在荧光粒子FP1的全部发射光谱的大部分上 的发射。随着粒子移动通过流动通道并且由固定地变化的激发波长激发，来自粒子的发射 被在探测器通道中测量。在该示例中，对激发源的光谱的扫描基本提供了FP1的全部激发光 谱的扫描，因为FP1的激发光谱被大部分包括在由激发光源提供的波长的范围内。
[0101]长通滤波器的使用通常优先于带通滤波器的使用，因为长通滤波器将所测量的荧 光反射的量最小化，但是这两者都是可以使用的。
[0102] 限定了探测通道的长通滤波器排除了激发光到达探测器。因为探测器通道与激发 束光谱明显分离，所以激发束可以在全部时间都打开。因此，图5中示出的实施例可以使用 图1和图2中示出的仪器和方法，或者图3和图4中示出的仪器和方法。
[0103] 图6
[0104] 图6描绘了本发明的另一个实施例的激发束光谱和探测器通道，以及第二示例性 荧光粒子(在这里被称作为FP2)的激发和发射光谱。FP2的激发光谱610和发射光谱620仅为 了示意性目的而示出，以帮助于理解本发明，并且不意图表示任何具体荧光染料的光谱。X 轴是波长，并且y轴是用于示意性说明标准化光谱的任意刻度。在该示例中，荧光粒子表现 在约51 Onm处的激发峰和在约585nm处的发射峰(具有75nm的斯托克斯频移）。
[0105] 激发束光谱的极限（由激发源发射的波长的范围）和探测通道的极限（用于探测粒 子荧光的波长的范围）被示意性地示出为在粒子光谱下方沿着X轴的条。在该示例中，假设 激发束的光谱的范围从450到600nm。第一探测通道640与图5的探测通道相同，并且探测波 长比约630nm更长的发射。第二探测通道630由第二长通滤波器限定，并且探测波长比约 550nm更长的全部发射。因此，第二长通滤波器排除了波长比550nm更低的激发光到达探测 器。
[0106] 如可以从图6看到的，FP2的发射极值恰好在探测器通道640的截止波长的左侧，并 且FP2的全部发射落到探测器通道640内的部分仅为FP2的全部发射光谱的一小部分。虽然 来自FP2的发射可以使用探测器通道640测量，但是期望减小探测敏感度，因为来自FP2的大 部分发射由长通滤波器阻挡。
[0107] 第二探测通道630探测波长比约550更长的发射，并且被构造为探测由FP2发射的 全部光的大部分。然而，探