数关系，即可计算出待测发酵液中HC的转化率，进而快速检测 出发酵液中HC的含量。
[0047] 所述的步骤(1仲抱子悬液的浓度控制在n/ml/i = 3 X 106到3 X 107之间。
[004引所述的步骤间中接种量在5%-10%之间，摇床培养条件为28°C、180r/min;培养时 间约为72h。
[0049] 所述的步骤间中投料RSA要用80 %的工业酒精助溶。
[0050] 所述的步骤(4)中发酵液和等量的乙酸乙醋浓硫酸要充分萃取，再室溫下静置一段 时间。
[0051 ] 所述的步骤间中标品与浓硫酸反应的时间准确控制在15min。
[0化2]
[0053] 所述的步骤做中胆备液的配置按W下步骤操作：
[0054] 精确称取氨化可的松标准品5mg，加无水乙醇溶解后定容于1 OmL容量瓶中，配置成 浓度为0.5mg/mL的胆备液，在4 °C下冷藏保存。RSA、RS、表氨化可的松标准品溶液的配置同 上。
[0055] 所述的步骤例中不同体积配比的RSA、HC、EHC标准品溶液，可按照W下配比进行 (其中HC的含量百分比即为HC的转化率）：
[0056] 所述的步骤脚中根据K = ( A474nm-A日3日nm) /A474nm，计算出当X = 0.6时的数值Κο，并分 别对转化率在0-60%之间，及转化率在60%-95%之间的数据进行拟合，得出两个转化率X 与Α474皿、A日3日nm之间的函数关系公式。
[0057] 所述的步骤(9)中将待测试样在474nm、535nm处的0D值代入公式：K=(A474nm- As35nm)/Α474Γ?;当於柏，转化率在0-0.6之间，选择转化率在0-60 %之间的公式一，计算出肥的 转化率；当K〉或=Κ〇，转化率在0.6-1之间，选择转化率在60%-95%之间的公式二，计算出 HC的转化率;进而快速测定发酵液中HC的转化率。
[0化引实施例1
[0059] (1)取具有不同HC转化率的1号、2号、3号菌株的新鲜斜面用无菌水制成抱子悬液，， 取ImL接种于盛有30mL种子培养基的25〇1^立角瓶中，28°C、180r/min摇床振荡培养20h。
[0060] 间将得到的种子培养液，接种于盛有50mL发酵培养基的500mLS角瓶中，摇床振荡 培养。
[0061 ] 间当发酵液的pH降至3.8 W下后，调节pH为6.5，投入0.25 %的RSA，继续培养至 7化。
[0062] (4)将步骤间得到的发酵液中加入等量的乙酸乙醋。充分萃取后取化L上层有机相 置于96孔石英酶标板中。每一份待测试样对应Ξ个平行样。
[0063] (5)精确称取氨化可的松标准品5mg，加无水乙醇溶解后定容于lOmL容量瓶中，配 置成浓度为〇.5mg/mL的胆备液，在4°C下冷藏保存。RSA、RS、表氨化可的松标准品溶液的配 置同上。
[0064] 做按照肥不同转化率，保持总质量为0.0 25mg，添加不同体积配比的RSA、肥、E肥标 准品溶液于96孔石英酶标板中。RSA、肥、E肥标准品溶液的体积配比见表1。对于同一肥转化 率的样品平行Ξ份。
[00化]表1 RSA、肥、EHC标准品的含量百分比
[0066]
[0067]
[006引例待步骤(4)中的乙酸乙醋、步骤做中的无水乙醇完全挥发后，同时加入2(Κ)化的浓 硫酸，反应15min，分别在474nm、535nm波长处测定吸光度，结果如表2。
[0069]表2不同含量百分比的混合标品吸光度测定数据
[0070]
[0071] 脚将表2中不同HC转化率对应474nm和535皿处的OD值整理，通过singmapolt软件 拟合成Ξ维立体平面图，并由此得出转化率X与A474nm、As35nm之间的函数关系。HC转化率在0- 0.6之间的拟合模型见图1，得到的公式一为：X = 4.4686+0.9341*A474nm-19.1657*A535nm- 0.1161*(A474nm)2+19.5822*(A日3日皿)2。肥转化率在0.6-1之间的拟合模型见图2,得到的公式 二为：X = 〇 . 2275+8.5673*A474皿-16.6402*A535nm+3.8789*(A474nm)2+15.831*(As35皿）2。
[00巧 （9服据(A474皿-A日3日nm)/A474皿计算出当X = 0.6时的数值Κ0 = 0.53126。将表2中待测 试样在474nm、535nm处的0D值代入公式K=(A474nm-A日3日nm)/A474nm，根据计算出的Κ值与Κο比 较，将转化率在0-0.6之间的与0.6-1之间的分开，通过公式一、公式二即可计算出待测发酵 液中HC的转化率，结果如表3。进而快速检测出发酵液中HC的转化率。
[0073] 表3可见光双波长检测法发酵液中氨化可的松转化率的测定结果
[0074]
[0075] (10)将步骤(4)中得到的发酵液进行高效液相色谱检测HC的转化率，色谱条件:采用 C18柱(4.6 X 250mm，5μπι)，流动相为V(甲醇）：V(水）=70:30，流量0.5mL/min，进样量20化， 柱溫25°C;UV 242nm检测。检测结果如图3、图4、表4。
[0076] 表4高效液相色谱法与可见光双波长检测氨化可的松的转化率测定结果
[0077]
[0078] ~结果显示，所建立的方法一可见光双波长检测法可W粗略测定发酵液中HC的转化 率。与药典方法高效液相色谱法相比，测定结果基本一致，。该法操作简便，节约时间，效率 高，适用于发酵液中氨化可的松转化率的快速检验，为高通量筛选高产氨化可的松的菌株 提供了是一种快速、有效的检测方法。
【主权项】
1. 一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于:步骤如下： ⑴利用主产物氢化可的松、gu产物表氢化可的松、底物17-羟基孕留-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯遇浓硫酸反应显不同颜色的特性，使用乙酸乙酯将发酵液中成分萃取出来，加入 浓硫酸，使其与硫酸发生反应，导致颜色发生相应变化； ⑵先对HC/浓硫酸、EHC/浓硫酸、RSA/浓硫酸进行全波长扫描，得到HC/浓硫酸、RSA/浓 硫酸的最大吸收峰值分别为474nm、535nm; (3)根据朗伯比尔定律结合三维数据建模二阶校正得出氢化可的松转化率的计算公式； ⑷通过测定发酵液中的成分与浓硫酸反应在可见光双波长下的OD值，即可计算出待测 发酵液中氢化可的松的转化率。2. 根据权利要求1所述的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于:具 体步骤如下： ⑴待测菌种发酵产生的发酵液降至3.8以下后，调节pH为6.5,投入0.25%的RSA，继续 培养至72h; ⑵将步骤⑴得到的发酵液中加入等量的乙酸乙酯，充分萃取后取6yL上层有机相置于 96孔石英酶标板中； (3)待步骤⑵中96孔石英酶标板中的乙酸乙酯挥发后，加入200yL浓硫酸，反应15min后 使用酶标仪检测其在474nm处和535nm处的OD值； ⑷将氢化可的松、表氢化可的松、RSA、RS的标准品加无水乙醇溶解后，分别配置成浓度 为0.5mg/mL的备液； (5) 将步骤⑷得到的此、1?44!1(：，按照!1(：不同转化率，保持总质量为0.0251^，添加不同 体积配比的RSA、HC、EHC标准品溶液于96孔石英酶标板中，待无水乙醇挥发后，加入200yL的 浓硫酸，反应15min，分别在474nm、535nm波长处测定吸光度； (6) 将步骤(5)测得不同HC转化率对应474nm和535nm处的OD值整理，根据(Α474·-Α535·)/ A474nm计算出当Χ = 0.6时的数值Kq;再通过singmapolt软件拟合成三维立体平面图，并由此 得出转化率X与A474nm、A535nm之间的函数关系； ⑵将步骤(5)中待测试样在474nm、535nm处的0D值代入公式K = (Α474·-Α535·)/A474·，很 据计算出的K值，将转化率在0-0.6之间的与0.6-1之间的分开，再步骤(6)得到的转化率X与 Α474Γ?、A535nm之间的函数关系，即可计算出待测发酵液中HC的转化率，进而快速检测出发酵 液中HC的含量。3. 根据权利要求2所述的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于:所 述的步骤⑴中投料RSA要用80 %的工业酒精助溶。4. 根据权利要求2所述的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于:所 述的步骤⑵中发酵液和等量的乙酸乙酯浓硫酸要充分萃取，再室温下静置一段时间。5. 根据权利要求2所述的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于:所 述的步骤⑶中标品与浓硫酸反应的时间准确控制在15min。
【专利摘要】本发明涉及一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，利用发酵后的主产物氢化可的松、副产物表氢化可的松及底物RSA与浓硫酸反应显示不同颜色，根据朗伯比尔定律结合三维数据建模，通过可见光双波长检测，即可间接计算发酵液中氢化可的松的转化率。本发明操作简单快捷，测试时间短、试样用量小，容易实现并行操作，精确性高。重复性误差在10％以内；可检出氢化可的松的转化率在10％-95％之间，检测方法操作简单快捷，单个样品的测试时间在20min之内，而薄层层析法及高效液相色谱法所需时间较长。
【IPC分类】G01N21/31
【公开号】CN105628631
【申请号】CN201511014228
【发明人】路福平, 叶松, 王洪彬, 毛淑红
【申请人】天津科技大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年12月28日