一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物转化制药中药物产量的检验分析领域，设及一种氨化可的松生物 催化转化率的快速检测方法，适用于药物的生物转化工艺过程研究和检测。
【背景技术】
[0002] 氨化可的松是一种肾上腺皮质激素类药物，在临床上应用广泛。同时它还是生产 泼尼松等其他类高效皮质激素药物的基础原料。
[0003] 肥的生产是W化合物RS(17-^基孕酱-4-締-3,20-二酬)或化合物354(17-径基孕 酱-4-締-3,20-二酬-21-醋酸醋)为底物经过微生物的ΙΙβ-径基化反应得到。微生物菌种对 HC的转化率和收率影响很大，因此选育高产氨化可的松的优良菌种一直是工业上的研究目 标。
[0004] 工业上选育高产氨化可的松的优良菌种，一般是采用诱变育种方式。诱变育种过 程中，经诱变产生高产菌株的频率很低，因此都需要从庞大的菌种库中检出目标菌种。氨化 可的松转化率的检测，一般是首先用有机溶剂将摇瓶发酵的发酵液成分萃取出来，再通过 薄层层析法，对HC的产量作定性检测。最终通过高效液相色谱法，确定菌种对氨化可的松的 转化率。
[0005] 薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数工厂检测都在使用的方法。薄膜层 析法，存在取样量大，萃取剂易挥发，操作繁琐，定量不准确，易受环境干扰等问题；另有液 相色谱法测定结果准确，但检验时间过长，程序复杂，仪器价格昂贵，均不适于生产现场快 速检验的要求。因此，运些点已远远不能满足现代检测，W及高通量筛选高转化率菌种的要 求。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种精度和灵敏度都高的氨化 可的松生物催化转化率的快速检测方法。
[0007] 本发明实现目的的技术方案是：
[000引一种氨化可的松生物催化转化率的快速检测方法，步骤如下：
[0009] (1)利用主产物氨化可的松、副产物表氨化可的松、底物17-径基孕酱-4-締-3,20- 二酬-21-醋酸醋遇浓硫酸反应显不同颜色的特性，使用乙酸乙醋将发酵液中成分萃取出 来，加入浓硫酸，使其与硫酸发生反应，导致颜色发生相应变化；
[0010]间先对HC/浓硫酸、EHC/浓硫酸、RSA/浓硫酸进行全波长扫描，得到HC/浓硫酸、 RSA/浓硫酸的最大吸收峰值分别为474nm、535nm;
[0011] 间根据朗伯比尔定律结合Ξ维数据建模二阶校正得出氨化可的松转化率的计算 公式；
[0012] (4)通过测定发酵液中的成分与浓硫酸反应在可见光双波长下的0D值，即可计算出 待测发酵液中氨化可的松的转化率。
[oou] 而且，具体步骤如下：
[0014] (1)待测菌种发酵产生的发酵液降至3.8W下后，调节pH为6.5,投入0.25%的RSA， 继续培养至72h;
[0015] 间将步骤(1)得到的发酵液中加入等量的乙酸乙醋，充分萃取后取化L上层有机相 置于96孔石英酶标板中；
[0016] 间待步骤间中96孔石英酶标板中的乙酸乙醋挥发后，加入200化浓硫酸，反应 15min后使用酶标仪检测其在474nm处和535nm处的0D值；
[0017] (4)将氨化可的松、表氨化可的松、RSA、RS的标准品加无水乙醇溶解后，分别配置成 浓度为〇.5mg/mL的胆备液；
[001引巧)将步骤(4備到的HC、RSA、EHC，按照HC不同转化率，保持总质量为0.025mg，添加 不同体积配比的RSA、肥、E肥标准品溶液于96孔石英酶标板中，待无水乙醇挥发后，加入200 化的浓硫酸，反应15min，分别在474nm、535nm波长处测定吸光度；
[0019] (6)将步骤间测得不同HC转化率对应474nm和535nm处的0D值整理，根据(A474nm- A53日皿)/A474皿计算出当X = 0.6时的数值Κο;再通过singmapolt软件拟合成^维立体平面图， 并由此得出转化率X与A474皿、A日3日皿之间的函数关系；
[0020] 例将步骤间中待测试样在474nm、535nm处的0D值代入公式K=(A474nm-A日3日nm)/ A474?，很据计算出的K值，将转化率在0-0.6之间的与0.6-1之间的分开，再步骤做得到的转 化率X与A474皿、A日3日皿之间的函数关系，即可计算出待测发酵液中HC的转化率，进而快速检测 出发酵液中HC的含量。
[0021 ] 而且，所述的步骤(1)中投料RSA要用80 %的工业酒精助溶。
[0022]而且，所述的步骤间中发酵液和等量的乙酸乙醋浓硫酸要充分萃取，再室溫下静 置一段时间。
[0023 ] 而且，所述的步骤间中标品与浓硫酸反应的时间准确控制在15min。
[0024] 本发明的优点和积极效果是：
[0025] 1、本发明操作简单快捷，测试时间短、试样用量小，容易实现并行操作，精确性高。 重复性误差在10 % W内；可检出氨化可的松的转化率在10 % -95 %之间，检测方法操作简单 快捷，单个样品的测试时间在20min之内，而薄层层析法及高效液相色谱法所需时间较长。
[0026] 2、本发明提出的方法能快速检测发酵液中HC的转化率，极大的提高菌种筛选效 率，为高通量筛选高效菌株，提高酱体药物氨化可的松的转化效率提供了可靠的保证。
[0027] 3、本发明提供的检测方法检测试样用量小，容易实现并行操作;检测方法的精确 性高，几乎不受环境条件影响，重复性误差在5% W内。精度和灵敏度均高于薄层层析法。
[0028] 4、本发明提供的检测方法适用于高产氨化可的松的菌株的高通量筛选，克服了传 统筛选优良菌种方法中操作困难、筛选工作量大且效率低下的缺点，大大缩短了筛选周期， 提高了工作效率。
【附图说明】
[0029] 图1是氨化可的松转化率小于60%的Ξ维双波长吸光度数据图；
[0030] 图2是氨化可的松转化率大于60%的Ξ维双波长吸光度数据图；
[0031] 图3是1号菌株发酵液成分的HPLC检测结果；
[0032] 图4是2号菌株发酵液成分的HPLC检测结果；
[0033] 图5是3号菌株发酵液成分的HPLC检测结果。
【具体实施方式】
[0034] 下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术 手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发 明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背 离本发明实质和范围的前提下，对运些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改 动也属于本发明的保护范围。
[0035] 本发明公开了一种氨化可的松生物催化转化率的快速检测方法，利用主产物氨化 可的松化C)、副产物表氨化可的松化HC)、底物17-径基孕酱-4-締-3,20-二酬-21-醋酸醋 (RSA)遇浓硫酸反应显不同颜色的特性，使用乙酸乙醋将发酵液中成分萃取出来，W适当的 比例加入浓硫酸，使其与硫酸发生反应，导致颜色发生相应变化。先对HC/浓硫酸、E肥/浓硫 酸、RSA/浓硫酸进行全波长扫描，得到HC/浓硫酸、RSA/浓硫酸的最大吸收峰值分别为 474nm、535nm;再根据朗伯比尔定律结合Ξ维数据建模二阶校正得出肥转化率的计算公式。
[0036] 实验结果表明：采用可见光双波长检测法，根据朗伯比尔定律结合Ξ维数据建模， 通过测定发酵液中的成分与浓硫酸反应在可见光双波长下的0D值，即可计算粗略出待测发 酵液中HC的转化率。
[0037] 具体的氨化可的松的转化率的快速检测方法，其特征在于:所述方法包括W下步 骤：
[003引（：L値株斜面用无菌水制成抱子悬液，取ImL接种于盛有30mL种子培养基的250mLS 角瓶中，28°C、180r/min摇床振荡培养20h。
[0039] 间将步骤过)中得到的种子培养液，接种于盛有50mL发酵培养基的500mLS角瓶中， 摇床振荡培养。
[0040] 间检测步骤间中的发酵液降至3.8 W下后，调节pH为6.5，投入0.25 %的RSA，继续 培养至7化。
[0041] (4)将步骤间得到的发酵液中加入等量的乙酸乙醋。充分萃取后取化L上层有机相 置于96孔石英酶标板中。
[0042] 间待步骤(4)中96孔石英酶标板中的乙酸乙醋挥发后，加入200化浓硫酸，反应 15min后使用酶标仪检测其在474nm处和535nm处的0D值。
[0043] 做将氨化可的松、表氨化可的松、RSA、RS的标准品加无水乙醇溶解后，分别配置成 浓度为〇.5mg/mL的胆备液。
[0044] 例将步骤做得到的HC、RSA、EHC，按照HC不同转化率，保持总质量为0.025mg，添加 不同体积配比的RSA、肥、E肥标准品溶液于96孔石英酶标板中，待无水乙醇挥发后，加入200 化的浓硫酸，反应15min，分别在474nm、535nm波长处测定吸光度。
[0045] 设)将步骤例测得不同HC转化率对应474nm和535nm处的0D值整理，根据（A474nm- A53日皿)/A474皿计算出当X = 0.6时的数值Κο;再通过singmapolt软件拟合成^维立体平面图， 并由此得出转化率X与A474皿、A日3日皿之间的函数关系。
[0046] (9)将步骤间中待测试样在474nm、535nm处的0D值代入公式K=(A474nm-A日3日nm)/ A474n"，很据计算出的Κ值，将转化率在0-0.6之间的与0.6-1之间的分开，再步骤脚得到的转 化率X与Α474皿、A日3日皿之间的函