一种快速测定蝉花样品中多球壳菌素含量的方法
【技术领域】
[0001] 虽然利用高效液相色谱化PLC)可W较准确地检测出样品中多球壳菌素的含量，但 是由于赠花样品中多球壳菌素含量较低，譬如多糖、肤、氨基酸等其它一些复杂成分均会对 其HPLC的检测造成较大干扰，故在进行HPLC前还需对赠花提取液中的多球壳菌素进行分离 纯化处理，从而导致整个实验步骤繁琐、耗时周期长，并且实验所需的仪器设备也较昂贵， 上述运些因素都不利于检测赠花中多球壳菌素技术的推广，最终也限制了更大地开发、利 用赠花市场价值的空间。
【背景技术】
[0002] 赠花(Cordyc邱S cicadae)，又名赠蛹草、赠茸、冠赠、胡赠等，属虫生真菌，是我国 传统的名贵中药材。它是由±中赠的幼虫被虫草菌感染、寄生后死亡，真菌汲取幼虫尸体的 营养从而形成的虫草菌丝体，当虫体内的菌丝体逐渐繁殖直至突破虫体长出类似花朵的 "芽"，构成具有动、植物两种形态特征的虫体与菌丝复合体。由于赠花在提高人体免疫力、 抗疲劳、保肾、改善睡眠、抗肿瘤、保肝、抗福射和明目等诸多方面均具有良好的效果，赠花 的药用价值和保健功效引起了人们的极大关注，当前市场上W赠花为主要原料的药品及保 健品也越来越多，多球壳菌素(Myriocin，ISP-l)作为赠花中的重要活性成分，其含量的高 低对于赠花制品功效的发挥至关重要。同时赠花中多球壳菌素的含量也可作为评判赠花质 量的标准。目前现有的检测赠花中多球壳菌素的方法手段比较单一，主要是利用高效液相 色谱化PLC)对样品中的多球壳菌素含量进行检测。
【发明内容】
[0003] -种快速测定赠花样品中多球壳菌素含量的方法，包括W下部分： 1、实验准备 (1)制备酵母YTO固体培养基 分别准确称取Ig酵母提取物（yeast extract)、2g蛋白腺（peptone)、1.5g琼脂（agar) 于250ml锥形瓶，加入90ml蒸馈水，用锡锥纸封口然后置于高压灭菌锅进行灭菌处理（121 °C，20min)，待灭菌完成后再加入10ml已灭菌的20%D-葡萄糖(D-glucose)，最后趁热导入 培养皿中，每个培养皿中20ml培养基，干燥后置于4°C冰箱待备用。
[0004] (2)制备酵母平板菌落 取BY474U基因型：MATa;Ms3 Δ 1; leu2 Δ 〇;metl5 Δ 〇;ura3 Δ 0)酵母的甘油菌化 1 于 1ml灭菌去离子水中并混合，然后取10化1混合液于90化1灭菌去离子水中并混合，吸取50μ1 的最终混合液涂布在（1)制备的YTO平板上，置于3(TC培养箱中1~2天，待平板上的酵母单 菌落长出。（适宜稀释倍数需参照甘油菌浓度） (3)制备酵母SDC液体培养基 按照下表的组分准确称取所需物质并加去离子水定容至1000ml，揽拌均匀后调pH至 6.0，最后使用0.22WI1的滤膜进行抽滤灭菌。
[0005] ~~(4)制备多球壳菌素对照品溶液 配制多球壳菌素对照品母液:精确称取Img多球壳菌素对照品并溶于1ml 95%乙醇，振 荡均匀使药品完全溶解。
[0006] 配制多球壳菌素工作液:按照下表所示梯度浓度稀释母液_
(5)制备赠花样品提取液 提取方法可W选择超声提取法、加热回流提取法、浸泡提取法等多种方法，此次选择浸 泡提取法，即准确称取2g赠花纯粉样品于50ml锥形瓶，加入20ml 95%乙醇，摇荡混匀并置 于空气恒溫摇床中4她(20化9111，30°(：)。然后将料液离屯、（800化9111，5111111)，转移所得上清液 即为赠花样品浸泡提取液。
[0007] (6)制备植物銷氨醇(P服)母液 精确称取0.0016g植物銷氨醇粉末于1.5ml EP管，力的5 %乙醇定容至1ml，溶解完全后 即得5mM的P服母液。
[000引 2、实验步骤 1. 从长有BY4741菌落的YTO平板上挑取5个单克隆于盛有2ml SDC培养基的灭菌锥形 瓶，将瓶口用锡锥纸包裹W防染菌，在20化pm，30°C的条件下过夜培养至饱和； 2. 测饱和菌液的0D595皿值，并取一定体积的菌液于300mlSDC培养基，使起始0D595皿 值为0.005,然后将之分到33个50ml灭菌Ξ角瓶中，每瓶含9ml菌液，每11瓶为一次实验，共 进行3次重复，并且每瓶分别加入下列药物，第一组：1ml 95%乙醇（阴性对照组）；第二组： 1ml梯度浓度的多球壳菌素对照品溶液（阳性对照组）；第Ξ组：1ml样品浸泡提取液(实验样 品测量组）；第四组：1ml样品浸泡提取液+1化1 5mM PHS母液（实验样品验证组）；第五组： 1ml 3.5μg/ml多球壳菌素(拟合曲线测量组）；第六组：1ml 3.5μg/ml多球壳菌素+1化1 5mM PHS母液(拟合曲线验证组）；具体加药操作如下表所示：
3.将运些瓶子置于30 °C空气摇床，200rpm培养。
[0009] 4.在培养1她、2地、30h后利用分光光度计或酶标仪分别测每瓶菌液的0D595nm值， 分别记录下来后用Excel、SPSS或化igin等统计软件进行数据分析(如表1、表2)。
[0010] 3、实验结果、分析 因为多球壳菌素具有强免疫活性，可W通过抑制丝氨酸栋桐酷转移酶(SPT)活性发挥 生物活性。而丝氨酸栋桐酷转移酶(SPT)作为胞内合成銷醋的第一步酶，控制着胞内銷醋水 平，銷醋水平关联胞内众多生理过程，其含量下降会抑制细胞生长。所W在酵母细胞生长时 添加不同浓度的多球壳菌素会使细胞生长速度受到不同程度的阻滞。从表2数据可W印证 上述理论，同时再额外添加植物銷氨醇(銷醋合成原料，SPT下游产物)可W完全恢复由于多 球壳菌素对銷醋合成抑制作用导致细胞生长速度减慢的趋势，从而证明实验中酵母细胞生 长速度的减慢是由于添加多球壳菌素造成的。W0D值为横轴，多球壳菌素浓度为纵轴，选取 阴性、阳性对照组检测出的0D平均值为坐标点分别按照药物不同处理时间进行曲线拟合， 结果如图1所示。分别将拟合曲线验证组测得的0D值和实验样品测量组的0D值代入标准曲 线方程计算多球壳菌素浓度并与准确浓度对比，如表3。表3中发现，通过拟合曲线方程计算 出来的多球壳菌素理论浓度值与实际值均存在一定的差异，但是可W发现随着拟合曲线的 拟合优度R~2与1不断接近，W及加药处理时间的延长，理论与实际差值在不断缩小，最终精 度到达lOng/ml，实验结果比较理想。
[0011] 该方法较原始方法化PLC法)的优势在于简便、快速、高效，只需对原始样品进行简 单粗提取，免去了复杂的分离纯化过程;而且可同时测定多个样品，数据结果输出快;整个 实验所需器材及试剂均较便宜，运些优点都便于该法的推广、利用。
[0012] 表1
【附图说明】
[0013]附图1为W芽殖酵母为实验材料绘制出的在加药后一定时间内多球壳菌素浓度与 0D值关系的生长曲线，供快速测量多球壳菌素含量所用：W0D值为横轴，多球壳菌素浓度 (ng/ml)为纵轴，选取阴性、阳性对照组检测出的0D平均值为坐标点分别按照药物不同处理 时间（18h、24h、30h)进行曲线拟合，结果如图1所示，图中各点表现为相应时间节点内菌落 平均0D值与多球壳菌素浓度的对应关系，图右下侧列出了绘制拟合曲线所计算出的函数关 系式W及R2值W供参考。
【主权项】
1. 制备蝴花样品浸泡提取液的最佳料液比：蝴花(g) :95%乙醇(ml)(w/v)=l: 10。2. 制作标准曲线时，多球壳菌素对照品浓度梯度的选择--0、100、200、300、400、500、 600ng/ml以及检测OD值时间点的选择--18h、24h、30h;额外加入植物鞘氨醇的浓度--5 μΜ〇
【专利摘要】本发明意在提出一种新的针对蝉花中多球壳菌素含量的快速检测方法，虽然利用高效液相色谱(HPLC)可以较准确地检测出样品中多球壳菌素的含量，但是由于蝉花样品中多球壳菌素含量较低，譬如多糖、肽、氨基酸等其它一些复杂成分均会对其HPLC的检测造成较大干扰，故在进行HPLC前还需对蝉花提取液中的多球壳菌素进行分离纯化处理，从而导致整个实验步骤繁琐、耗时周期长，并且实验所需的仪器设备也较昂贵。我们已将所需的酵母生长标准曲线制作出供检测多球壳菌素所用。
【IPC分类】G01N21/31, G01N1/28
【公开号】CN105628629
【申请号】CN201510999370
【发明人】秦宇豪, 翟琪尧, 刘科
【申请人】四川大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年12月28日