全血量至少2mL;
[0039] (2)将枸橼酸钠抗凝全血引入试剂卡四个检测通道，在配套检测设备中测定四个 通道的血小板凝集水平；
[0040] (3)利用配套软件计算通道I血小板聚集率AggI;
[0041 ] (4)利用配套软件计算通道II血小板聚集率Aggll;
[0042] (5)利用配套软件计算通道III血小板聚集率Agglll;
[0043] (6)利用配套软件计算通道IV血小板聚集率AgglV;
[0044] (7)根据血小板聚集率AggI质控GpIIb/IIIa受体活性；
[0045] (8)根据如下公式计算出血小板聚集百分率（Platelet Aggregation percentage，PAP%)和抗血小板药物的抑制率（Inhibition，Inh%):
[0046] PAP% = [ (AgglV-Agglll)/ (Aggll-Agglll) ]*100%
[0047] Inh% = 100%-PAP%
[0048] 如图1所示，样品待测液体样品从进样口进入试剂卡流入储液池，而后由储液池流 入样品流动通道沿着试剂卡中的通道流至四个检测通道中，当四个检测通道中充满样品 后，试剂卡自动切断检测通道与流动通道的连通。检测通道中的试剂溶解在样品中，由于试 剂含有包被有纤维蛋白原的微球，因此会与样品中的血小板发生结合反应。血小板聚集程 度的变化会引起透过检测通道的透光率发生变化，这一变化值被仪器捕捉并通过光电信号 软件转换成电信号变化曲线。四个通道中分别包含了不同的血小板激活剂，通道I采用的是 凝血因子IV作为血小板激活剂，诱导血小板GPIIb/ma受体与包被在染料微球上的纤维蛋 白原发生结合反应，用于质控样品中血小板GP n b/ma受体活性是否正常;通道n采用的是 TRAP-14作为凝血酶受体激活剂，最大化激活血小板与包被在染料微球上的纤维蛋白原发 生结合反应，反应程度直接反应患者服药前血小板的活性;通道m为空白对照，用于判断样 品中血小板自身是否发生一定程度聚集，并通过公式计算能消除血小板自身轻微聚集的干 扰;通道IV采用的是ADP作为血小板P2Y12和P2Y1受体激活剂，同时采用A2P5P/A3P5P作为抑 制剂特异性的抑制P2Y1受体活性，使ADP只能特异性激活血小板P2Y12受体，从而与包被在 染料微球上的纤维蛋白原发生结合反应，聚集的程度反应噻吩并吡啶类抗血小板药物的药 效，血小板聚集反应强，表明噻吩并吡啶类抗血小板药物药效低，血小板聚集反应低，表明 噻吩并吡啶类抗血小板药物有疗效。
[0049] 四个检测通道同时对样品血小板聚集功能进行检测，该组合方式能在检测样品血 小板聚集功能的同时对样品中血小板自身活性进行质控。通道n和通道IV的检测结果能分 别反应患者服用噻吩并吡啶类抗血小板药物前后血小板的活性，避免了对病人进行服药前 和服药后的二次静脉采血。血小板激活剂的选择组合方式未有报道，凝血因子IV价格低廉， TRAP-14激活血小板活性强，A2P5P/A3P5P抑制血小板P2Y1受体特异性强。
[0050] 另一方面，本发明提供了如第一方面所述的试剂卡在制造检测噻吩并吡啶类抗血 小板药物疗效的装置中的应用。本发明所述的试剂卡可单独作为一种简单的检测装置，也 可以作为检测装置的一部分进行使用。
[0051 ]相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0052]本发明采用四通道的试剂卡检测噻吩并吡啶类抗血小板药物疗效，不仅具有很好 的稳定性和特异性，而且还提高了检测速度和效率，减小了检验的操作时间和成本;通过在 光学比浊法的检测原理上做了改进，制备的噻吩并吡啶类抗血小板药物疗效检测卡，相比 于目前国内外市场上的其他血小板聚集功能检测方法，能直接对全血样品进行检测，无需 离心血浆等繁琐的操作；四通道同时检测血小板凝集水平，能消除由血小板自身轻微聚集 带来的干扰，减小背景值，检测结果具有更好的特异性和准确性，检测快速，操作简便。而传 统的光学比浊法检测血小板聚集需要对全血进行离心取富血小板血浆和贫血小板血浆，增 加了操作时间和检验成本，而且对血小板自身活性有一定的影响。
【附图说明】
[0053]图1是为本发明的试剂卡的结构示意图；
[0054] 图2是血小板活性质控单位换算图；
[0055] 图3是对全血中氯吡格雷药物对血小板聚集率的检测结果图；
[0056] 图4是对全血中不同浓度的氯吡格雷药物对血小板聚集率的检测结果图；
[0057] 图5是本发明试剂卡检测方法与LTA法检测结果的相关性结果图。
【具体实施方式】
[0058] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明 了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0059] 实施例1
[0060] 微球标记
[0061 ] (1)洗球:取100此的荧光微球，用MES PH4 ? 5缓冲液lmL洗涤两次，8000g，4°C离心 lOmin，弃上清，超声一分钟后加入MES pH4.5复溶至lmL。
[0062] (2)活化微球:分别加入EDC和NHS溶液至终浓度为0.5mg/mL，室温活化15分钟，4°C 离心（8000g，lOmin)弃上清，用0.02M pH8.5硼酸盐缓冲液lmL洗涤两次后用该缓冲液复溶 至 lmL。
[0063] (3)加入标记蛋白：将活化后的微球超声一分钟，涡旋混匀器混匀，加入Gpnb/ma 受体配基至终浓度为0.5mg/mL，室温孵育2小时。
[0064] (4)封闭：孵育结束后，加入终浓度0.5%的BSA，室温封闭30min。
[0065] (5)离心:封闭结束后，4°C下8000g离心30min。吸取上清并弃掉。
[0066] (6)复溶:加入lmL 0.02M pH8.5硼酸盐缓冲液，4°C离心(8000g，10min)弃上清，洗 涤两次后加入复溶液定容至lmL，4°C保存备用。
[0067] 微球冻干
[0068]标记完成的微球与冻干保护剂、助悬剂以及防腐剂按一定比例混合，并平均分成3 份，编号为I，II，IV，分别加入相对应的血小板激活剂，其中凝血因子IV的终浓度为0.8mM， TRAP-14的终浓度为50yM，ADP的终浓度为15yM，P2Yl拮抗剂的终浓度为50yM。通过精确计量 的流体注液系统将微球溶液制备成液滴，液滴体积控制在10-30yL，本实施例中优选20此。 制备的液滴在液氮中速冻成小球，并将小球转移至试剂卡中，在冷冻干燥机中冻干成药球 I、药球II和药球IV。具体冻干保护剂、助悬剂以及防腐剂的组成及浓度如下：
[0070] 试剂卡组装
[0071] 将冻干的药球I、药球II和药球IV分别按对应的关系装入未焊接密封的试剂卡检 测通道I、通道II和通道IV中，并在每个通道中分别装入一颗直径约2_的钢珠，用超声波焊 接机对试剂卡进行超声焊接密封，使试剂卡的检测通道密闭，能保证样品在试剂卡中不泄 露。
[0072] 实施例2
[0073] l、GpIIb/IIIa受体活性抑制
[0074] 采集31例健康志愿者的血样，3.2%枸橼酸钠抗凝，每例各取2支，每支2mL。取适量 的GpIIb/IIIa受体活性抑制剂阿昔单抗(Reopro)，用0.01M PBS缓冲液溶解配制成0.15mM。 每例血样取一支作为实验组，分别加入〇.15mM的阿昔单抗2yL，血样中阿昔单抗终浓度为 0.15yM。轻轻颠倒混匀血样10次，使得阿昔单抗与血样充分混匀，37度孵育1小时。剩余每例 血样分别加入2yL 0.01M的PBS缓冲液，37度孵育1小时，用作对照组。
[0075] GpIIb/IIIa受体活性检测
[0076]上述实验孵育结束后，取实验组血样通过本发明的试剂卡在相配套的光学检测设 备上检测GpIIb/IIIa受体活性，通过软件自动绘制曲线并计算AggI，并依次完成剩余实验 组和对照组血样的检测，检测结果见图2。从图2可以看出，对照组中由于没有加入GpIIb/ Ilia受体活性抑制剂，GpIIb/IIIa受体活性正常，AggI 2 60%;实验组中加入了GpIIb/IIIa 受体活性抑制剂，GpIIb/IIIa受体活性受到了抑制，Aggl< 60%。考虑到个体性的差异以及 检测中可能会出现的离群值，设定GpIIb/IIIa受体活性质控值AggI为65%，质控GpIIb/ Ilia受体活性准确度更高。即AggI 2 65%，则样品GpIIb/IIIa受体活性处于正常水平，未受 药物抑制;Aggl<65%，则认为样品GpIIb/IIIa受体活性存在一定的抑制率并延长了出血 时间，患者不适用于本发明的试剂卡。
[0077] 实施例3
[0078]氯吡格雷药物抑制率评估检测
[0079] 采集服用氯吡格雷药物患者的枸橼酸钠全血2mL，将采血管轻轻颠倒混匀数次。将 噻吩并吡啶类抗血小板药物疗效检测试剂卡插入相配套的光学比浊检测设备中，将采血管 插入试剂卡的进样针上，点击启动，开始检测。仪器自动检测试剂卡四个检测槽的透光率变 化程度，并通过相应的软件转换成电信号，绘制出电信号