一种难辨梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶-毒素联检试剂条的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种体外诊断类医疗器械，尤其涉及一种难辨梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶-毒素联检试剂条。
【背景技术】
[0002]难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile，CD)是引起抗生素相关性腹泻和肠炎最主要的病原菌，被认为是医院内感染性腹泻最主要的原因。感染CD的临床表现可以从无症状携带，轻中度腹湾到致命性的伪膜性肠炎(pseudomenbranous colitis,PMC)，中毒性巨结肠及肠穿孔等。随着抗生素的滥用，化疗以及呼吸机等侵入性治疗的增多和推广，以及人口老年化，CDAD的发病率和死亡率呈逐年增加的趋势，尤其在过去十年，出现越来越多的CDAD病例，原来的低危人群也有发展为严重病例的风险，而高毒力菌株的出现和传播更使病情严重化，增加了患者的死亡率。难辨梭状芽孢杆菌相关性疾病(Clostridiumdifficile -associated disease, Q)AD)已逐渐成为一个严重的公众健康问题，其在年老体弱患者中的死亡率可高达25%。早期正确的诊断对病人的管理和感染的控制显得尤为重要，正确的诊断对获得可靠的疫情监测数据，有效追踪感染案例，病人获得早期有效的诊治，有效控制CD的传播和减少CDI的发病率和死亡率具有重要的意义。
[0003]根据2010年美国卫生保健流行病学协会(the Society for HealthcareEpidem1logy of America，SHEA)和美国感染病协会(the Infect1us Diseases Societyof America，IDSA)对成人⑶I临床实施指南推荐，两步法检测用于诊断⑶1:谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，GDH)检测作为初筛试验，阳性样本进一步行细胞毒素分析(cell cytotoxicity assay，CCA)或毒素培养(toxigenic culture，TC)检测确诊。
[0004]首先谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，⑶H)检测为初筛试验，GDH是⑶的一种膜蛋白，产毒株和非产毒株均有该蛋白，其产量远大于细菌毒素产量，故GDH检测比毒素检测灵敏性更高而特异性更低。研究显示GDH的EIA检测具有很高的灵敏性(98%)和阴性预测值(99.7%)，因此EIA检测⑶H是目前比较常用的⑶筛选试验。
[0005]第二部是检测难辨梭状芽孢杆菌毒素，细胞培养细胞毒素分析(thecell-culture cytotoxicity assay，CCA)和毒素培养(toxigenic culture，TC)被认为是诊断CDI感染的金标准。CCA是将过滤除菌的粪便标本上清加入单层细胞培养上清中，共培养24-48小时后观察毒素，主要是TcdB引起的细胞病变。为观察CD毒素引起的特异细胞病变，试验需要同时平行做加入CD抗毒素的中和试验。TC则需要先接种粪便标本在CD选择性培养基上，然后用EIA或CCA检测⑶分泌的毒素。厌氧培养一般需要48小时左右。较之CCA，TC具有更高的灵敏性。但不管是CCA还是TC，都需要专门的设备和技术人员，且耗时，不适合推广使用。
[0006]Real-time PCR检测CD的毒素基因是近年发展起来的一种新方法。Real-time PCR检测的特异性在90 — 95%，灵敏性在95 — 96% Aeal — time PCR的缺点在于由于其过于灵敏造成的假阳性，尤其是住院并由于其他原因造成腹泻的患者或CD的无症状携带者。另一个限制Real — time PCR广泛应用的因素在于其需要专门的仪器和专业的技术人员，而且单人份检测价格昂贵。
[0007]目前临床最常用的⑶I检测方法是酶联免疫分析(enzymeimmunoassay, EIA)检测CD毒素TcdA或TcdA和/或TcdB。这种方法可测试多人份样本，操作简单快速，技术要求不高，但缺点是也需要与专门仪器设备配套，对试验人专业性具有一定要求，不利于大规模样本的快速筛查及现场检验操作。
[0008]对于难辨梭状芽孢杆菌的检测方式，不管是采用EIA检测GDH作为初筛方法，还是对毒素分析中采用CCA、TC方法或Real-time PCR方法、酶联免疫检测(EIAs)检测TcdA和/或TcdB，目前所使用的试剂均为单成分检测试剂盒，不能实现GDH，TcdA和B同时检测，均需两步法才能完成对难辨梭状芽孢杆菌的确诊。
【发明内容】
[0009]为了克服现有的对难辨梭状芽孢杆菌检测方法中不能实现一步法检测的不足，本实用新型提供了一种难辨梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶-毒素联检试剂条，可同时检测GDH、TcdA和TcdB，将现有各种检测方法中的两步法操作缩短为一步法操作，即一次试验操作，SP可完成谷氨酸脱氢酶(GDH)、难辨梭状芽孢杆菌毒素TcdA和TcdB毒素的同时检测，进而一步法完成对难辨梭状杆菌感染的全部诊断。
[0010]为解决上述缺陷本实用新型提供的技术方案是:
[0011]—种难辨梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶-毒素联检试剂条，包括塑料基板、吸收垫、硝酸纤维素膜、胶体金垫和样本垫各层状结构，所述吸收垫固定在塑料基板的上端部，硝酸纤维素膜固定在吸收垫的下部、塑料基板的中间部分，其特征在于:在硝酸纤维素膜上的质控区设有质控C线，检测区设有检测Tl线、检测T2线、检测T3线三条线，质控C线包被羊抗鼠多抗，检测区检测Tl线包被谷氨脱氢酶(GDH)抗体，检测T2线包被难辨梭状芽孢杆菌毒素Tcd A抗体，检测T3线被为难辨梭状芽孢杆菌毒素Tcd B抗体;所述样本垫包括M2a、M2b、M3三层结构;所述样本垫M2a固定在塑料基板的下端部、硝酸纤维素膜下部，与硝酸纤维素膜紧靠但不重叠;所述胶体金垫位于样本垫M2a外层中上部;样本垫M3位于胶体金垫外层中下部，下端部长于胶体金垫;样本垫M2b位于样本垫M3外层;透明保护胶带位于样本垫M2b外层上端部，并黏附于硝酸纤维素膜的下端。
[0012]本实用新型提供的难辨梭状芽孢杆菌检测试剂盒在硝酸纤维素膜上的质控区包被有四条线，通过一次试验操作可同时完成谷氨酸脱氢酶(GDH)、难辨梭状芽孢杆菌毒素TcdA和TcdB毒素三种物质的联合检测，缩短难辨梭状芽孢杆菌的检测时间。
[0013]进一步的，本实用新型提供的难辨梭状芽孢杆菌检测试剂条，其特征在于:样本垫M2b上端与样本垫M2a平齐，样本垫M2b下端长于样本垫M3、略短于样本垫M2a。
[0014]进一步的，为了增强纤维素膜的性能，本实用新型提供的难辨梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶-毒素联检试剂条，其特征在于:所述硝酸纤维素膜为高蛋白亲和性的高分子纤维素膜。
[0015]进一步的，为了增强胶体金垫的吸附能力，本实用新型提供的难辨梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶-毒素联检试剂条，其特征在于:所述胶体金垫为无纺布，上面吸附有含胶体金颗粒一谷氨脱氢酶(GDH)抗体、胶体金颗粒一难辨梭状芽孢杆菌毒素Tcd A抗体和胶体金颗粒一难辨梭状芽孢杆菌毒素Tcd B抗体的复合物。
[0016]进一步的，为了增强样本垫的吸水能力，本实用新型提供的难辨梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶-毒素联检试剂条，其特征在于:所述样本垫为无纺布或玻璃纤维。
[0017]进一步的，为了增强吸收垫的吸收剩余样本的能力，所述吸收垫为海绵材料。
[0018]进一步的，为了将本申请试剂条的各层状结构固定牢固，塑料基板、吸收垫、硝酸纤维素膜、胶体金垫和样本垫M2a、M2b、M3各层状结构之间通过双面胶带固定。
[0019]本申请难辨梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶-毒素联检试剂条由以下结构部分组成:
[0020]硝酸纤维素膜:高蛋白亲和性的高分子纤维素膜，经预处理后包被抗特异性谷氨酸脱氢酶抗体和Tcd A、Tcd B抗体，制备为反应膜用来作为系统反应的载体和显示反应结果O
[0021 ] M2a, M2b，M3:样本垫，选用有较强吸水能力的无纺布、玻璃纤维，经特殊处理后，为反应系统提供适合的反应条件，并帮助吸取样本。
[0022]胶体金垫:吸附力较强的无纺布，为胶体金标记抗特异性谷氨酸脱氢酶抗体和TcdA、Tcd B抗体的固相载体，上面吸附有含胶体金颗粒--谷氨脱氢酶(GDH)抗体、胶体金颗粒一难辨梭状芽孢杆菌毒素Tcd A抗体和胶体金颗粒一难辨梭状芽孢杆菌毒素Tcd B抗体的复合物。