一种胫骨植入物抗感染效果的评价方法与流程

本发明涉及一种胫骨植入物抗感染效果的评价方法，属于骨科植入物领域。

背景技术：

骨关节炎是引起关节慢性疼痛和功能障碍最常见的疾病，人工膝关节置换和髋关节置换是治疗该疾病最行之有效的治疗方式。感染和无菌性松动是引起手术失败最主要的两个原因。因此提高植入假体与骨的生物相容性和预防感染是预防手术失败的重要手段。同时，系统性应用抗生素由于手术过程中破坏了手术部位的血运及术后手术部位周围伴随有组织坏死，抗生素难以达到手术部位，并且系统性大量使用抗生素伴随有肾毒性及肝毒性。因此，对骨科植入物的抗感染效果作一有效的评价，将成为衡量骨科植入物的效用的重要依据。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种胫骨植入物抗感染效果的评价方法。

本发明采用了如下技术方案：

一种胫骨植入物抗感染效果的评价方法，其特征在于，包括：向片状植入物上加载不同抗生素的步骤，以及将片状植入物植入实验动物骨骼上的步骤。

进一步，本发明的胫骨植入物感染的评价方法，还可以具有这样的特征：其中，所述片状植入物为：纯钛或者阳极化纳米管钛。

进一步，本发明的胫骨植入物感染的评价方法，还可以具有这样的特征：其中，所述抗生素为：庆大霉素，将片状植入物分为四组：纯钛，纯钛加载庆大霉素，阳极化纳米管钛，阳极化纳米管钛加载庆大霉素。

进一步，本发明的胫骨植入物感染的评价方法，还可以具有这样的特征，还包括：向骨髓腔中注入0.1mlpbs含3×10⁹cfu/ml的金黄色葡萄球菌atcc25923的步骤。

进一步，本发明的胫骨植入物感染的评价方法，还可以具有这样的特征，还包括：监测体温的步骤。

进一步，本发明的胫骨植入物感染的评价方法，还可以具有这样的特征，还包括：监测植入后1天，术后3周，术后6周的影像学变化的步骤。

进一步，本发明的胫骨植入物感染的评价方法，还可以具有这样的特征，还包括：使用细胞微生物学、组织学及组织病理学评价感染情况的步骤。

进一步，本发明的胫骨植入物感染的评价方法，还可以具有这样的特征：组织病理学的评估标准为：

组织病理学的评估标准为：

骨内急性炎症：无急性炎症反应：0分，轻微或中等急性炎症反应，但无髓内脓肿：1分，中等或者严重的急性炎症反应，但无髓内脓肿：2分，轻微或中等急性炎症反应，伴随有髓内脓肿：3分，中等或者严重的急性炎症反应，伴随有髓内脓肿：4分。

骨内慢性炎症：无慢性炎症反应：0分，轻微或中等慢性炎症，但无明显髓内纤维化：1分，中等或者严重的慢性炎症，但无明显髓内纤维化：2分，轻微或中等炎症反应，伴有明显髓内纤维化：3分，中等或者严重的炎症反应，伴有明显髓内纤维化：4分。

进一步，本发明的胫骨植入物感染的评价方法，还可以具有这样的特征：组织病理学的评估标准还包括如下评分：

骨膜炎症反应：无骨膜炎症反应：0分，轻微或中等骨膜炎症反应，但无骨膜下脓肿形成：1分，中等或者严重的骨膜炎症反应，但无骨膜下脓肿形成：2分，轻微或中等骨膜炎症反应，伴有骨膜下脓肿形成：3分，中等或者严重的炎症反应，伴有骨膜下脓肿形成4分，骨坏死：无骨坏死证据：0分，单个部位骨坏死，但无死骨形成：1分，多个部位骨坏死，但无死骨形成：2分，单个部位骨坏死，伴有死骨形成：3分，多个部位骨坏死，伴有死骨形成：4分。

进一步，本发明的胫骨植入物抗感染效果的评价方法，还可以具有这样的特征：统计各组评分，将加入抗生素组的评分与未加抗生素组的评分相比较，计算是否有统计学上的差异。

发明的有益效果

本发明的胫骨植入物抗感染效果的评价方法，采用了片型材料，其制备简单，成本低。

进一步，目前体外实验中使用阳极化纳米管钛材料均为片型。关节置换中的假体的表面也多为平面状，与片状材料表面相似，其形状更接近临床使用的假体平面。

进一步，由于在评价方法对各评价指标使用了统一的评分标准，因此本发明的方法为体内植入不同片型材料加载抗生素预防感染的评价提供了可靠的依据。

附图说明

图1是为术后x线侧位片显示片型植入物材料的位置。

图2为术后x线正位片显示片型植入物材料的位置。

具体实施方式

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。

本方法包括如下步骤:

术前将新西兰大白兔称重和麻醉处理；将经过麻醉处理的新西兰大白兔仰卧位，暴露胫骨内侧，于胫骨平台内测备皮；沿着胫骨近端向远端做纵行切口长约2-3cm；钝性分离皮下筋膜及肌肉层，暴露胫骨近端；于胫骨平台下缘1-2cm处开骨槽，植入四种不同的移植物，同时注入0.1mlpbs含3×10⁹cfu/ml的金黄色葡萄球菌(atcc25923)。随后，监测术前，术后3天，7天，14天，21天，28天，35天及42天的体温、体重、白细胞的变化，监测术1天，术后3周，术后6周的影像学变化，42天后处死兔子，通过细胞微生物学、组织学及组织病理学评价感染情况。根据本发明的实施例，发明人发现，上述方法所获得动物模型可以有效地对多种片状材料加载不同抗生素预防感染进行评价，从而对不同片状材料加载不同抗生素预防感染的体内实验研究提供一种新的动物模型。具体实施方式如下：

一、材料与方法

1材料

1.1试剂

(1)健康新西兰大白兔32只(海军医学研究所动物养殖中心，12-16周龄、体重2.2-2.8kg)

(2)硫酸庆大霉素(sangonbiotecha100304-0001)。

(3)胰酶大豆培养基(oxoidltd.,basingstoke,hampshire,england)

(4)金黄色葡萄球菌(atcc25923,americantypeculturecollection,manassas,美国)

(5)戊巴比妥(德国默克公司)

(6)骨腊

(7)70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％乙醇

(8)甲基丙烯酸甲酯单体

(9)4％多聚甲醛

(10)二甲苯

(11)双蒸水

(12)he染色试剂盒(基尔顿生物科技公司，中国)

1.2器材

(1)一次性口罩(中国新乡市康民卫材开发有限公司)

(2)棉垫，纱布，棉球(中国新乡市康民卫材开发有限公司)

(3)—次性手术铺巾，一次性手术衣(中国新乡市康民卫材开发有限公司)

(4)1ml,2.5ml,5ml注射器(中国江西洪达医疗器械集团有限公司)

(5)敷贴(中国湖北五湖医疗器械集团有限公司)

(6)胶布(中国明尼苏达矿业制造医用器材有限公司)

(7)缝合线(强生中国医疗器材有限公司)，3-0用于缝皮肤

(8)缝合针(中国上海浦东金环医疗用品股份有限公司)注意，三棱针用于缝合皮肤，圆针用于缝合肌肉和结缔组织

(9)手术器械(中国上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂)

(10)2mm骨刀(yydmi医械)

(11)电子体温计(terumo,中国浙江)

(12)电子秤(tcs,中国上海)

(13)切片机(德国exakt公司的exakt310)

(14)x线片机(西门子德国)

(15)组织研磨机(净信科技，tissuelyser-48,上海)

(16)手术台(中国兴化市同昌不锈钢制品厂)

(17)莱卡sm2500s显微镜用薄片切片机(bensheim,德国)

2.方法

2.1实验分组

健康称成年的32只新西兰大白兔被分为4组，雌雄不限，体重范围为2.2-2.8kg，12-16周龄，按植入材料不同随机分为4组，分别为纯钛组、纯钛+庆大霉素组、阳极化纳米钛组、阳极化纳米钛+庆大霉素组。每组8只兔子。

2.2术前麻醉，监测一般情况及备皮

术前调节好室内温度及湿度，温度为26℃，湿度为50-70％。术前对新西兰大白兔称重，体重范围为2.2-2.8kg，术前监测体温，术前耳缘静脉抽血监测白细胞。术前对手术器械经高温高压消毒后放在铺有一次性无菌铺巾单的托盘上。

将新西兰大白兔进行称重之后再对大白兔进行麻醉处理。具体地，可以根据大白兔的体重给以适当剂量的麻药进行麻醉。麻醉处理具体可以按照下列步骤进行:采用3％戊巴比妥钠溶液按照30mg/kg的剂量对所述大白兔耳缘静脉注射。3％戊巴比妥钠溶液是按照3g/100ml配置得到的。

进一步地，将经上述麻醉处理后的大白兔仰卧位，暴露胫骨内侧，对手术部位进行备皮处理。

备皮处理具体操作为于胫骨内侧部位进行剃毛，得到的备皮区域为上缘至腹股沟区，下缘至踝关节处，内侧至后正中线，外侧至外正中线。由此可以便于切口区干净，无毛发。发明人发现，如果备皮区域过小，则会有大量的毛发影响手术。

2.2术中操作

根据本发明的具体示例，剃毛并清洁皮肤后，用碘酊对剃除毛的部位进行消毒，再用75％的酒精进行二次消毒、脱碘。备皮处理完成后，在备皮位置铺上洞巾，暴露切口部位。

备皮处理后，沿胫骨内侧做切口，钝性分离皮下筋膜及肌肉层，暴露内侧胫骨近端。发明人发现，在本部分操作过程中，切口不要过关节线，不破坏关节囊。另外，发明人发现，根据新西兰大白兔的体型大小可以适当调节切口大小，具体长度控制在2-3cm比较合适。通常采用体重适中的新西兰大白兔，其切口大小可以为2cm。另外，实验中发明人发现，切口过大则会导致创伤严重，出血过多，影响实验进行。

暴露胫骨近端后，于胫骨近端用2mm的骨刀开骨槽，并用骨刀扩大骨槽，骨槽长度和宽度根据片状阳极化纳米钛加载抗生素材料的长度和厚度调整，骨槽整体的长度为5-7mm，进一步的，用薄骨刀清除适量骨髓以获得足够的空间，直到能植入移植物。在清除骨髓的过程中，薄骨刀方向要与胫骨垂直，尽量不要与胫骨垂直方向成角，成角后容易导致皮质骨劈裂，成角也容易破坏更多的骨髓腔。在清除骨髓的过程中，要反复得调试是否有足够的空间植入片状的阳极化纳米管加载抗生素的移植物，尽可能多的保留骨髓。

片状材料分为四组，分别为纯钛，纯钛加载庆大霉素，阳极化纳米管钛，阳极化纳米管钛加载庆大霉素，片型材料的大小为0.25cm*0.25cm，四种不同的片型材料分别植入胫骨近端，随后用适量的骨腊封闭骨槽，随后用1ml的注射器注入0.1mlpbs含3×10⁹cfu/ml的金黄色葡萄球菌atcc25923。当植入片状移植物后骨髓腔有比较多的渗血，直接注入0.1mlpbs含3×10⁹cfu/ml会随着渗血渗出，污染骨髓腔周围的组织，而且如果细菌渗出后骨髓腔的细菌量不够不能引起骨髓腔的急性感染，故在次步骤中，在骨髓腔中注入细菌之前用骨腊封闭骨槽。

进一步地，用缝线依次缝合深筋膜，肌肉及皮肤。

2.3术后监测

进一步地，术后1天，术后3周，术后6对新西兰大白兔行x线正侧位检查。首先将大白兔取仰卧位，行正位x线检查，随后取侧卧位，行侧位x线检查。检查的结果如图1和图2所示。在行侧位x线检查的时候，要将大白兔的双下肢分开，避免重影。同时，对x线对影像学的变化进行评分，评分标准为：1.整体印象；2.骨膜反应；3.软组织肿胀；4.骨髓炎；5.畸形；6.死骨形成；7.自发性骨折；第1-5条的评分为标准如下0分(不存在),1分(轻微),2分(中等程度),3分(严重)；第6-7条的评分标准为0分(不存在)或者1分(存在).最大评分值为17分。

进一步地，术后3天，7天，14天，21天，28天，35天，42天监测体温，体重及白细胞的变化。

2.4获取手术标本

进一步地，术后第42天以耳缘静脉空气注射法处死兔子，对手术部位行备皮，消毒，铺单，无菌条件下获取含移植物的胫骨近端，用作随后的微生物学、组织病理学评估。

2.5微生物学、组织学及组织病理学评估

进一步地，对移植物及骨组织行微生物学分析。获得包含移植物的胫骨近端后，将骨劈裂，取出移植物，将片状阳极化纳米管钛在琼脂板上进行翻滚，随后将琼脂板在37℃的孵箱中培养24小时，观察四种不同材料的细菌生长情况。劈裂的胫骨组织称重，然后液氮冷冻，随后用骨组织研磨仪将骨组织研成粉末状，500mg的骨组织加入到6ml的无菌的pbs中，涡旋振荡2分钟将骨组织混匀。组织悬液10000rpm条件下离心10s并获取100μl上清液连续稀释10倍，上清液一式三份均匀铺于琼脂板上，于37℃的孵育24小时，记录24小时候琼脂板表面的细菌集落形成情况，并计算细菌集落形成数/骨组织重量的比值。

进一步地，对骨组织及移植物行组织学分析。获得的含移植物的胫骨近端用4％的多聚甲醛固定24h，用不同浓度梯度的酒精将组织脱水，二甲苯透明化骨组织，并用石蜡包埋，随后用leicasm2500s切片机沿着骨组织的长轴方向垂直于移植物切片，随后对切片行甲苯胺蓝染色检验新骨形成情况及骨组织感染情况。染色后的组织切片根据以下标准进行评分：1.整体印象；2.脓肿形成；3.皮质层扩大；4.死骨形成；5.皮质骨破坏；在1-4项中0分(不存在)1分(存在)，5项中0分(不存在)，1分(轻微)，2分(严重)。

进一步地，对骨组织及移植物行组织病理学分析。获得的含移植物的胫骨近端用4％的多聚甲醛固定24h，并用edta对骨组织脱钙28天，28天后将移植物从骨组织中取出，将骨组织石蜡包埋，用切片机将石蜡包埋的骨组织沿胫骨长轴方向切成厚度约为5μm的组织切片。将切好的骨组织切片行he染色，对骨组织进行病理改变进行评估，具体的评估标准为：

骨内急性炎症：0分(无急性炎症反应)，1分(轻微或中等急性炎症反应，但无髓内脓肿)，2分(中等或者严重的急性炎症反应，但无髓内脓肿)，3分(轻微或中等急性炎症反应，伴随有髓内脓肿)，4分(中等或者严重的急性炎症反应，伴随有髓内脓肿)。

骨内慢性炎症：0分(无慢性炎症反应)，1分(轻微或中等慢性炎症，但无明显髓内纤维化)，2分(中等或者严重的慢性炎症，但无明显髓内纤维化)，3分(轻微或中等炎症反应，伴有明显髓内纤维化)，4分(中等或者严重的炎症反应，伴有明显髓内纤维化)。

骨膜炎症反应：0分(无骨膜炎症反应)，1分(轻微或中等骨膜炎症反应，但无骨膜下脓肿形成)，2分(中等或者严重的骨膜炎症反应，但无骨膜下脓肿形成)，3分(轻微或中等骨膜炎症反应，伴有骨膜下脓肿形成)，4分(中等或者严重的炎症反应，伴有骨膜下脓肿形成)

骨坏死：0分(无骨坏死证据)，1分(单个部位骨坏死，但无死骨形成)，2分(多个部位骨坏死，但无死骨形成)，3分(单个部位骨坏死，伴有死骨形成)，4分(多个部位骨坏死，伴有死骨形成)

2.6统计学分析

采用spss16.0软件对数据进行分析。经检验所有数据均符合正态分布，计数资料均用平均值±标准差表示。四组大白兔的体温、体重、白细胞、影像学评分、组织病理学评分均采用单因素方差分析，组间对比采用lsd-t检验。微生物学分析的结果采用mann-whitneyu检验，两组间检验采用bonferroni–holm检验。p<0.05有统计学意义。

二、结果

1.体温、体重、白细胞的变化

术后体温变化：四组大白兔从术后地1天至第3天，体温逐渐升高，从第3天至第14天，体温逐渐下降，第14天至第42天体温保持平稳。第3天时，植入纯钛和阳极化纳米管钛的大白兔组的体温高于植入纯钛加载庆大霉素和阳极化纳米管钛加载庆大霉素大白兔组，其余时间点四组大白兔的体温无明显差异。

术后体重变化：四个实验组大白兔均在第3天时体重最低，第4天至第42天体重逐渐增加。第3天时，植入纯钛和阳极化纳米管钛大白兔组的体重小于植入纯钛加载庆大霉素和阳极化纳米管钛加载庆大霉素大白兔组，其余时间点四组大白兔的体重无明显差异。

术后白细胞变化：植入纯钛和阳极化纳米管钛大白兔组的白细胞从第1天至第3天逐渐升高，从第3天至第42天逐渐下降，而植入纯钛加载庆大霉素和阳极化纳米管钛加载庆大霉素大白兔组的白细胞从第1天至第7天逐渐升高，从第7天至第42天逐渐下降。植入阳极化纳米管钛加载庆大霉素大白兔组在第3天，35天及42天时白细胞计数明显低于植入纯钛和阳极化纳米管钛大白兔组，植入纯钛加载庆大霉素组大白兔组的白细胞在第3天、21天及42天时白细胞计数明显低于植入纯钛和阳极化纳米管钛大白兔组。

2.影像学评估

x线结果显示植入纯钛和阳极化纳米管钛大白兔组在21天时植入物附近的骨髓中存在骨髓炎、骨膜反应、软组织肿胀以及畸形，这些影像学表现在42天时更加明显。21天时，植入纯钛加载庆大霉素和阳极化纳米管钛加载庆大霉素大白兔组无明显的骨髓炎，但是42天时有轻微的骨髓炎、骨膜反应、软组织肿胀。

影像学评分：阳极化纳米钛+庆大霉素组纯钛组、纯钛+庆大霉素组、阳极化纳米钛组、纯钛组的评分在21天时分别为1.88±0.99,2.13±0.64,5±1.78,5.62±2，42天时分别为2.12±0.51,2.5±0.7,7.75±0.98,8±2.33。阳极化纳米钛+庆大霉素组纯钛组和纯钛+庆大霉素组的影像学评分明显低于阳极化纳米钛组和纯钛组。

3.微生物学评估

阳极化纳米钛+庆大霉素组纯钛组、纯钛+庆大霉素组形成的细菌集落数为分别为40.5±12.36和73.75±10.69，阳极化纳米钛组、纯钛组形成的细菌集落数均大于1000。阳极化纳米钛+庆大霉素组纯钛组、纯钛+庆大霉素组形成的细菌集落数明显小于阳极化纳米管钛和纯钛组。

阳极化纳米管钛+庆大霉素组纯钛组、纯钛+庆大霉素组、阳极化纳米管钛组、纯钛组中细菌集落数/每克骨的比值分别为7.08±2.5×10³，1.95±0.21×10³，3.15±0.82×10⁶，3.48±0.49×10⁶，阳极化纳米钛+庆大霉素组纯钛组、纯钛+庆大霉素组的细菌集落数/每克骨的比值明显小于阳极化纳米钛组、纯钛组。

3.组织学及组织病理学评估

组织学的结果显示在阳极化纳米钛组、纯钛组中伴随有感染的征象，而阳极化纳米钛+庆大霉素组、纯钛+庆大霉素组无明显感染的征象。阳极化纳米钛+庆大霉素组、纯钛+庆大霉素组、阳极化纳米钛组、纯钛组的组织学评分分别为2.25±0.5、2.5±0.58、3.5±0.58、3.25±0.5，阳极化纳米钛+庆大霉素组、纯钛+庆大霉素的组织学评分明显低于阳极化纳米钛组、纯钛组。同时，组织学结果同样显示阳极化纳米钛+庆大霉素组中形成的骨量最多。

组织病理学结果显示阳极化纳米钛+庆大霉素组、纯钛+庆大霉素组、阳极化纳米钛组、纯钛组的总的评分分别为3.5±1、4.5±1.3、11.25±2.06、11±0.82，阳极化纳米钛+庆大霉素组、纯钛+庆大霉素组的组织病理学评分明显低于阳极化纳米钛组、纯钛组。同时，组织病理学结果同样显示阳极化纳米钛+庆大霉素组中形成的骨量最多。

三、结论

上述实施例证明：阳极化纳米钛加载庆大霉素能预防感染，同时能促进骨形成。当然，本发明提供的方法，具有应用在其它类型的植入物中，以判断各种植入物的抗感染效果的前景。