积比为25 :1 ;然后将调好pH值的奶样于4°C、5000rpm离 心12min。取出，沉淀为酪蛋白，上清液为乳清蛋白，将上清液转移到另一离心管。用1M的 NaOH水溶液将上清液的pH值调回至7. 5，其中上清液与1M的NaOH水溶液的体积比为25:1。 将调好pH值的奶样于4°C、5000rpm离心15min，将离心后的上清收集，得到纯化的乳清。
[0037] 使用HiLoadTM16/10SPSepharoseHighperformance色谱柱，将其预先用 0? 4M 的NaCl、20mM的Na3P04 (pH7. 5)平衡5个柱体积。15ml脱脂乳通过注射器上样，进入上样环。 用0. 4M的NaCl、20mM的Na3P04(pH7. 5)平衡5个柱体积，未结合的蛋白收集到一离心管中， 用0. 4M-1M的NaCl、20mM的Na3P04(pH7. 5)洗脱15个柱体积，收集分离到的各个峰值蛋白， 并合并同一峰值的洗脱液。再用1M的NaCl、20mM的Na3P04(pH7. 5)继续洗脱2个柱体积， 最后用1M的NaCl、20mM的Na3P04(pH7. 5)洗脱5个柱体积。上述操作均在AKTApuriferlO 液相色谱仪上进行。最后得到在0.6M的NaCl的洗脱峰。收集该洗脱峰的洗脱液并进行超 滤浓缩和冷冻干燥，然后经N端测序和蛋白电泳，证明该洗脱峰为重组提纯的人乳铁蛋白 (hLF) 〇
[0038] 用提纯的人乳铁蛋白（hLF)免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细 胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗hLF 单克隆抗体的10个克隆的细胞株。将这些杂交瘤细胞株分别注射至小鼠腹腔，收集腹水， 亲和柱纯化得10种单克隆抗体。
[0039] 将这10种单克隆抗体两两组合得到45个组合，将各个组合分别制备胶体金免疫 试纸，具体地，将每一个组合中的一个抗体进行胶体金标记并制备金标垫，另外一个抗体用 于制备T线。
[0040] 胶体金的制备方法包括：将0. 01重量％的撤11(：14溶液加热煮沸后加入1重量％的 柠檬酸三钠溶液直至溶液的颜色完全变为透明的红色时，继续回流l〇min后停止加热，冷 却至室温，即得到胶体金。将单克隆抗体进行胶体金标记的方法包括：取lml制取好的胶体 金，用1重量％的K2C03调节pH值到8. 0,加入8yg单克隆抗体，混合均勾，室温反应40min; 加入5重量％的BSA至终浓度为0. 1重量％，静置30min;先用低速（1500r/min)离心15 分钟，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀；然后用l〇〇〇〇r/min离心30分钟；仔细吸出上清， 沉淀物用0.11111含1%834的0.邡？83&117.4)复溶，加入5%叠氮钠至终浓度为0.05%， 4°C保存。
[0041] 用喷金点膜机将第二单克隆抗体和羊抗鼠IgG喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平 行的检测T线和质控C线，然后烘干；将胶体金标记的第一单克隆抗体用喷金点膜机均匀的 喷在金标垫上；然后如图1所示，将样品垫、金标垫、喷有T线和C线的基膜（硝酸纤维素 膜）和吸水纸依次连接组装，而后裁切包装备用。共得到45种免疫胶体金试纸。对于金标 垫，喷金点膜机的喷涂速度为2. 0yL/cm。对于T线和C线，喷金点膜机的喷涂速度为1yL/ cm，T线为浓度lmg/mL的第二单克隆抗体，C线为浓度lmg/mL的羊抗鼠IgG抗体。
[0042] 将人乳铁蛋白的PBS溶液作为阳性样本，将牛乳铁蛋白PBS溶液作为阴性样本，对 上述45种免疫胶体金试纸进行筛选。去除44种对人乳铁蛋白呈现阴性反应或对牛乳铁蛋 白呈现阳性反应的免疫胶体金试纸，最终得到一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸能 够对10ng/mL的人乳铁蛋白PBS溶液呈现阳性反应，并且对100yg/mL的牛乳铁蛋白PBS 溶液不呈现阳性反应。该免疫胶体金试纸即为本实施例筛选得到的免疫胶体金试纸。该免 疫胶体金试纸所用的第一单克隆抗体是由杂交瘤细胞株3B4分泌得到的，该杂交瘤细胞株 的保藏编号为CGMCCN0. 10595 ;该免疫胶体金试纸所用的第二单克隆抗体是由杂交瘤细胞 株5C5分泌得到的，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCN0. 10594。经鉴定这两株株单克 隆抗体亚型均为IgGl+kappa。
[0043] 实施例2
[0044] 本实施例用于说明本发明的人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条（即实施例1 筛选得到的免疫胶体金试纸）在检验实际样本时的敏感性和特异性。
[0045] (1)样品制备：采集的牛奶、溶解的奶粉及液态乳制品。取约200y1的牛奶样品 加入样品管中。
[0046] (2)检测：取出实施例1筛选得到的免疫胶体金试纸试纸条，室温平衡20分钟，打 开包装取出试纸条，将试纸条按照箭头方向插入样品管中，静置10-15分钟，判定结果。
[0047] (3)结果判定：当时纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，没有出现肉眼可见的紫 红色检测线，判为阴性，记为"一"；当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，同时出现肉眼 可见的紫红色检测线，判为阳性，记为" + ";检测线颜色深度与待检抗原量成正比，颜色越深 说明待检抗原含量越高，质控线无条带则判为试纸条失效。判定结果示意图见附图2。
[0048] 选用购头的Sigma人乳铁蛋白标准品（纯化）的PBS洛液、人乳铁蛋白标准品（重 组表达）的PBS溶液、购买的Sigma牛乳铁蛋白标准品的PBS溶液、购买的Sigma羊乳铁 蛋白标准品的PBS溶液、以及购买的Sigma人溶菌酶标准品的PBS溶液和购买的Sigma人 a_乳清白蛋白标准品的PBS溶液进行特异性测定，检测结果如表1，结果表明，该试纸条可 以特异性识别人乳铁蛋白，但与牛乳铁蛋白、羊乳铁蛋白、人溶菌酶和人a-乳清白蛋白不 呈现阳性反应。部分检测结果如图3所示。
[0049] 表1试纸条特异性试验结果
[0050]
[0051] 将人乳铁蛋白标准品（纯化）和人乳铁蛋白标准品（重组表达）进行梯度稀释，用 胶体金试纸条进行灵敏度检测，检测结果见表2,表2结果显示，试纸条的灵敏度可达10ng/mL〇
[0052] 表2试纸条灵敏度试验结果
[0053]
[0054] 实施例3
[0055] 采集140份已知人乳铁蛋白阴性的牛奶（其中包括100份采集自位于河北大厂的 奶牛养殖场的非转基因奶牛，20份位于中国农业大学的奶牛养殖场的转人溶菌酶的转基因 奶牛和20份位于中国农业大学的奶牛养殖场的转人a-乳清白蛋白的转基因奶牛）、和22 份已知人乳铁蛋白阳性牛奶（采集自位于中国农业大学的奶牛养殖场，转人乳铁蛋白基因 奶牛），共162份样品，用实施例1筛选得到的免疫胶体金试纸进行盲测，测定结果显示140 份已知人乳铁蛋白阴性的牛奶均显示为检测阴性，22份已知人乳铁蛋白阳性牛奶均显示为 检测阳性，试纸条的诊断特异性为100%。部分测定结果图见图4和图5所示。
[0056] 根据实施例1-3的数据可见，本发明能够通过双抗夹心免疫试纸检测方法，对人 乳铁蛋白的检测取得lOng/mL的灵敏度，对牛乳铁蛋白和羊乳铁蛋白不呈现交叉反应，并 且对人溶菌酶转基因牛、人a_乳清白蛋白转基因牛不呈现交叉反应，具有较高的敏感度 和特异性。这可能是由于本发明的人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条所用的单克隆抗 体对能够高灵敏且高特异性地识别人乳铁蛋白，并且本发明的两个单克隆抗体能够分别针 对不同的抗原决定簇，由此特别适合用于双抗夹心免疫试纸的检测。
[0057] 以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简 单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0058]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0059] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的 吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；其特征在于，所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包 被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体；所述T线上包被 有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO. 10595的杂交瘤细胞株 分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO. 10594的杂交瘤细胞株分泌得到。2. 根据权利要求1所述的人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，其中，所述金标垫 中所含有胶体金标记的第一单克隆抗体是由5-100 y g/mL胶体金标记的第一单克隆抗体 溶液以0. 5-5 y L/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上干燥后得到的。3. 根据权利要求1所述的人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，其中，所述T线上包 被的第二单克隆抗体是由〇. 2-5mg/mL的第二单克隆抗体溶液以0. 2-4 y L/cm的喷涂速度 通过喷金点膜机喷涂在T线上干燥后得到的。4. 根据权利要求1所述的人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，其中，所述C线上包 被的羊抗鼠IgG的抗体是由0. 2-5mg/mL的羊抗鼠IgG的抗体溶液以0. 2-4 y L/cm的喷涂 速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥后得到的。
【专利摘要】本发明提供了一种人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体；所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCC？NO.10595的杂交瘤细胞株分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC？NO.10594的杂交瘤细胞株分泌。本发明能够通过双抗夹心免疫试纸检测方法，对人乳铁蛋白的检测取得10ng/mL的灵敏度，对牛乳铁蛋白和羊乳铁蛋白不呈现交叉反应，并且对人溶菌酶转基因牛、人α-乳清白蛋白转基因牛不呈现交叉反应。CGMCC No.1059420150508
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105021830
【申请号】CN201510459441
【发明人】王勤, 林祥梅, 刘晓飞, 冯春燕, 付伟, 李晓琳, 仇松寅, 刘丹丹
【申请人】中国检验检疫科学研究院
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月30日