一种头花蓼中黄酮苷活性组分的制备及应用
【专利摘要】本发明提供一种头花蓼黄酮苷活性组分的制备方法，通过将头花蓼粉碎，甲醇浸提，抽滤浓缩，先经硅胶色谱开口柱分离，再通过十八烷基键合硅胶开口柱纯化获得，此组分主要成分为五个黄酮苷化合物。本发明建立了抑制疫霉无性孢子囊产生的生物活性系统，并通过该系统，发现这种头花蓼黄酮苷组分和其中五个黄酮苷化合物均能显著抑制疫霉无性孢子囊的产生。本发明提供的头花蓼黄酮苷活性组分可在制备防治植物疫霉病的农药中应用。本发明制备方法简单，提取的产物纯度高，且头花蓼为易得便宜的中药，增加了头花蓼的药物用途，为抗疫霉菌农药的研发奠定了基础。
【专利说明】
一种头花蓼中黄酮苷活性组分的制备及应用
技术领域
[0001] 本发明属医药技术领域，涉及花寥中黄酮苷活性组分，尤其涉及花寥中黄酮苷活 性组分的制备方法及在制备抗疫霉病农药中的应用。
【背景技术】
[0002] 据联合国数据统计，世界人口正在逐年增加，预计到2050年世界人口将增长到8.9 亿，而有效耕地面积在不断减少，因此需要在较少的耕地面积上生产出更多的食物来避免 大范围饥饿。在影响作物生产的众多威胁中，植物病害的发生频率高、造成的损失也最为严 重。其中疫霉菌可引起世界上最具有毁灭性的植物病害，不仅危害农业生产，而且破坏自然 生态系统。另外，化学农药长期而广泛的应用使得大多数疫霉菌对许多杀菌剂产生了严重 的耐药性。因此，寻找和发现新的抗疫霉菌活性物质已成为急需解决的问题。
[0003] 目前，抗疫霉菌活性物质的研究主要集中在抑制菌丝生长和游动孢子萌发两方 面，对具有抑制疫霉菌无性生殖阶段孢子囊产生的活性物质的研究极少。而孢子囊的产生 是疫霉菌无性生殖阶段的关键时期，其产生的游动孢子是疫霉菌蔓延的基础，因此寻找具 有抑制无性孢子囊产生的天然活性物质，可能会发现新的作用靶点，有助于缓解或解决当 前日益严重的耐药性，推动植物疫病防治药物的开发与利用。
[0004]头花寥(Polygonum capitatum)属于寥科多年生草本植物，是我国著名的药用植 物。它的药用价值也已有研究:头花寥提取物及其在降血糖药物中的应用;头花寥提取物在 美白用品中的应用及美白用品；具有抗炎作用的热淋清颗粒原料头花寥提取物;具有抗淋 球菌作用的热淋清颗粒原料头花寥提取物；用于预防或治疗青春痘的头花寥组合物；用于 治疗或预防口腔疾病的头花寥组合物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种头花寥中黄酮苷活性组分，该组分主要包含五个黄酮苷 化合物，所述头花寥黄酮苷活性组分通过以下步骤制备获得：
[0006] (1)粉碎和浸提：
[0007] 将头花寥粉碎后，用工业级甲醇溶液在室温下浸提2次，每次1天，抽滤浓缩，得甲 醇浸提物粗样，用乙酸乙酯和水萃取分离，静置，将乙酸乙酯层减压浓缩旋干后，得到乙酸 乙酯层粗样；
[0008] (2)分离和纯化：
[0009] 将乙酸乙酯层粗样先经硅胶开口柱分离（200-300目，溶剂系统为正己烷：二氯甲 烷、二氯甲烷：乙酸乙酯和甲醇），再进一步通过十八烷基键合硅胶开口柱分离(溶剂系统为 甲醇：水），得到两个黄酮苷活性组分（洗脱体系分别为40%甲醇水溶液和50%甲醇水溶 液），两个活性组分再分别经十八烷基键合硅胶开口柱分离(溶剂系统为甲醇:水），得到较 纯的黄酮苷活性组分，然后再分别用反相HPLC纯化，流动相为甲醇水溶液，最终得到五个黄 酮苷化合物；五个化合物分别是myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside，quercetin 3-〇- iM)-glucopyranoside，quercetin 4 '-Ο-α-L-rhamnopyranoside，quercetin 3-〇-a-(2''_ galloyl)rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L_rhamnopyranoside〇
[0010] 所述步骤(2)中正己烷:二氯甲烷溶剂系统按体积比为：100:0，90:10，70:30，50: 50，30:70，10:90，0:100;随后二氯甲烷：乙酸乙酯溶剂系统按体积比为：90:10，70:30，50: 50,30:70,0:100;最后为甲醇。
[0011] 步骤(2)中第一次十八烷基键合硅胶开口柱纯化的甲醇:水溶剂系统按体积比为： 30:70,35:65,40:60,50:50,60:40,70:30,90:10,100:0。
[0012] 步骤(2)中第二次十八烷基键合硅胶开口柱纯化的甲醇:水溶剂系统按体积比分 别为：30:70,50:50和30:70,35:65,60:40。
[0013] 步骤(2)中HPLC纯化的色谱柱和流动相分别为CAPCELL PAKC18，甲醇:水=38:62 和Develos i 1 C30-UG-5，甲醇：水=48:52 〇
[0014] 本发明的另一个目的是提供所述的黄酮苷活性组分在制备抗疫霉菌农药中的应 用，所述黄酮苷活性组分主要包括五个黄酮苷化合物。本发明研究发现此活性组分及化合 物在抗疫霉菌化合物的筛选模型中，可以显著抑制疫霉菌无性孢子囊的产生，从而达到抑 制疫霉菌蔓延的效果。本发明所述药物是以黄酮苷活性组分或五个黄酮苷化合物为活性成 份，与药学上可接受的载体或赋形剂制备而成。
[0015] 本发明的药物剂型选用固体制剂或液体制剂。
[0016] 本发明提供的头花寥黄酮苷类组分及五个黄酮苷化合物在辣椒疫霉中表现出显 著的抑制疫霉菌无性孢子囊产生的活性。本发明制备方法简单，提取的产物纯度高，且头花 寥为易得便宜的中药，为抗疫霉菌药物的研发提供基础性研究，具有重要的现实意义。
【附图说明】
[0017] 图1是黄酮苷混合物A2、B2对疫霉菌无性孢子囊产生的抑制作用。
[0018] 图2是五个黄酮苷化合物对疫霉菌无性孢子囊产生的抑制作用。图中l:myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside，2:quercetin 3-〇-0-D_glucopyranoside，3:quercetin 4'-〇-a-L_rhamnopyranoside，4:quercetin 3_〇-a-(2''-galloyl)rhamnoside，5:kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside〇
[0019] 图3是五个黄酮苷化合物抑制疫霉菌无性孢子囊的产生的显微图片。图中a为阴性 对照：0 · 2%DMS0，b为阳性对照：甲霜灵（30yg/mL)，cSmyricetin7-0-a-L-rhamnopyranoside(30yM)d,quercetin 3-〇-0-D-glucopyranoside(3OyM)e,quercetin 4'-〇-a-L-rhamnopyranoside(3yM)f,quercetin 3_〇-a-(2"-ga11oy1)rhamnoside(3yM)g， kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside(10μΜ)〇
【具体实施方式】
[0020] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。但不应将此理解为本发明上述 主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范 围。
[0021 ]实施例1从头花寥中分离提取黄酮苷类组分及五个黄酮苷化合物的制备方法 [0022] (1)粉碎和浸提：
[0023] 取250g干燥的头花寥粉碎后，用2.5L甲醇(工业级)室温下浸提2次，每次1天，抽滤 浓缩，得甲醇浸提物粗样，用乙酸乙酯和水萃取分离，静置，将乙酸乙酯层减压浓缩旋干后， 得到乙酸乙酯层粗样9g。
[0024] (2)分离和纯化：
[0025]将乙酸乙酯层粗样先经硅胶开口柱分离（200-300目，以下溶剂系统按体积比，正 己烷:二氯甲烷溶剂系统按体积比为：100:0，90:10,70:30,50:50，30:70,10:90，0:100;随 后二氯甲烷：乙酸乙酯溶剂系统按体积比为 :90:10,70:30,50:50,30:70,0:100;最后为甲 醇）；将活性样品再用0DS开口柱分离(溶剂系统按体积比为甲醇：水=0:70，35:65，40:60， 50:50,60:40,70:30,90: 10,100:0);得到两个黄酮苷类混合物Al(975.7mgWPBl (267.4mg)，然后A1和B1分别用0DS开口柱分离（溶剂系统按体积比分别为甲醇：水为：30: 70，50 : 50和30 : 70，35 : 65，60 : 40 )，得到纯度较高黄酮苷混合物A2 (129 · 4mg)和B2 (139 · 9mg)。取A2 50mg用HPLC纯化，色谱条件:色谱柱PAKC18( 10/250mm)，流速3ml/min，检测 波长210nm，流动相为为甲醇：水= 38:62,得到化合物11171'；[061:;[117-0-€[-1-rhamnopyranoside(2 · 7mg，保留时间为19 · 5min)，quercetin 3-0-0-D_glucopyranoside (2.6mg,保留时间为25.3min)，quercetin 4'-0-a-L-rhamnopyranoside(35.8mg,保留时间 为38.0111丨11);取82 2011^用册1^：纯化，色谱条件：色谱柱030-1^-5(10/250_)，流速31111/1^11， 检测波长210nm，流动相为为甲醇:水=48:52，得到化合物quercetin 3-0-a-(2"_galloyl) rhamnoside (5 · 3mg，保留时间为54 · 8min)，kaempferol 3-0-a-L-rhamnopyranoside (2.5mg，保留时间为60.6min)。五个化合物的结构式如下：
[0027] 实施例2
[0028]对实施例1 所得化合物myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside，quercetin 3-〇_ iM)-glucopyranoside，quercetin 4 '-Ο-α-L-rhamnopyranoside，quercetin 3-〇-a-(2''_ galloyl )rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside的理化特征及化学结构 的定性鉴定：
[0029] 化合物myricetin 7-〇-a-L-rhamnopyranoside，quercetin 3-〇-0_D-glucopyranoside, quercetin 4'-〇-a-L_rhamnopyranoside，quercetin 3_〇-a-(2"-galloyl)rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L_rhamnopyranoside的结构经 1H NMR、MS和文 献比对确定
[0030] 化合物myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside的理化性质：棕黄色固体，分子式 为C2iH2〇Oi2;ESI-TOF-MS :m/z 465 · 1027(M+H).，氢谱数据：咕 NMR(500MHz，CD30D): δ = 6 · % (s,2H),6.37(d,lH,J = 2.0Hz) ,6.20(d,lH,J = 2.0Hz) ,5.31(d,lH,J = 1.5Hz) ,4.22(dd, 1H,J = 3,1.5Hz) ,3.79(dd,lH,J = 9.0,3.0Hz) ,3.52(m,lH) ,3.32(m,lH) ,0.96(d,3H,J = 6.5Hz)〇
[0031 ] 化合物quercetin 3_CHH)-glucopyranoside的理化性质：棕黄色固体，分子式为 C2iH2〇Oi2; ESI-TOF-MS: m/z 465 · 1027 (M+H) +，氢谱数据：咕 NMR( 500MHz，CD30D): δ = 7 · 70 (d， 1H, J = 2.0Hz) ,7.58(dd,lH, J = 8.5,2.0Hz) ,6.86(d, lH,J = 8.5Hz) ,6.19(d, 1H, J = 2.0Hz),6.38(d,lH ,J = 2.0Hz),5.22(d,lH ,J = 8.0Hz),3.47-3.20(m,4H),3.70(dd,lH ,J = 12.0,2.5Hz),3.57(dd,lH ,J = 13.0,6.0Hz)〇
[0032] 化合物quercetin 4'-〇-a-L-rhamnopyranoside的理化性质：棕黄色固体，分子式 为C2iH2〇Oii;ESI-TOF-MS:m/z 449 · 1114(M+H) +，氢谱数据：咕 NMR(500MHz，CD30D): δ = 7 · 33 (d,lH,J=1.5Hz) ,7.30(dd,lH,J = 8.0,1.5Hz) ,6.90(d,lH,J = 8.0Hz) ,6.18(d,lH,J = 2.0Hz) ,6.35(d,lH,J = 2.0Hz) ,5.34(s,lH) ,4.21(s,lH) ,3.39(m,lH) ,3.73(dd,lH,J = 9.5,3.0Hz)，3.43(m，lH)，0.93(d，3H，J = 6.0Hz)。
[0033] 化合物quercetin 3-〇_a-(2"-galloyl)rhamnoside的理化性质：黄色固体，分子 式为〇281124〇15$51-1'(^-]\^ :111/2 601.1179(]\1+!〇 +，氢谱数据：1!1匪1?(50冊!^，0)3〇0):3 = 7.36(d，lH，J = 2.0Hz)，7.34(dd，lH，J = 8.5,2.0Hz)，，7.07(s，2H)，6.93(d，lH，J = 85Hz)， 6.18(d，lH，J = 2.0Hz)，6.36(d，lH，J = 2.0Hz)，5.63(dd，lH，J = 3.5,2.0Hz)，5.50(d，lH，J = 1.5Hz)，4.01(m，lH)，3.47(m，2H)，1.03(d，3H，J = 6.0Hz)。
[0034] 化合物kaempferol 3-〇-a-L_rhamnopyranoside的理化性质：棕黄色固体，分子式 为C21H20O10; ESI-T0F-MS:m/z 443 · 1125 (M+H) +，氢谱数据：咕 NMR( 500MHz，CD30D): δ = 7 · 77 (d,lH,J = 8.5Hz) ,6.93(d,lH,J = 8.5Hz),6.18(d,lH,J = 2.0Hz),6.35(d,lH,J = 2.0Hz), 5.37(d,lH ,J=1.5Hz) ,4.21 (dd, 1H ,J = 3.0,1.5Hz), 3.70(dd, 1H, J = 9.0,3.5Hz), 3.33-3.16(m，2H)，0.92(d，3H，J = 5.5Hz)。
[0035] 实施例3
[0036] 黄酮苷类组分及五个黄酮苷化合物在抗疫霉菌筛选模型中，显著抑制疫霉菌无性 孢子囊的产生。
[0037] 目前抗疫霉菌活性物质的研究主要集中在抑制菌丝生长和游动孢子萌发两方面， 对具有抑制疫霉菌无性生殖阶段孢子囊产生的活性物质的研究极少。甲霜灵是目前在防治 植物疫病上面被最广泛应用的一种农药，可强烈抑制疫霉菌丝体的生长和无性孢子囊的产 生。本发明发现头花寥黄酮苷类混合物及五个黄酮苷化合物在辣椒疫霉模型中，显著疫霉 菌无性孢子囊的产生。
[0038] 1.实验方法：
[0039] (1)从10°C生化培养箱取出辣椒疫霉菌株，复苏到25°C，取一小块接种到20ml固体 培养皿（10%的V8 juice，0.02%的碳酸钙，2%的琼脂粉）中。25°C避光培养3-4d备用。
[0040] (2)取￥8加：[06 501111^，碳酸|丐0.28，于离心管中混勾，离心15111；[11(40001'/111；[11)，得到 V8juice上清液。
[0041] (3)取出在生化培养箱中避光培养3-4d的固体平板，用打孔器在菌丝边缘切下直 径为6mm的菌块，放在已灭菌的直径为6 cm的培养皿中心，然后加入1 OmL液体培养基（3 %的 V8juice上清液），放于25°C生化培养箱避光培养。48h后，除去培养基，并加入10mL无菌水/ 皿。样品加入时，先将样品别用20yL DMS0溶解，然后用移液枪吸取培养皿中的无菌水980L， 加入到样品溶液中，混匀后再均匀加入到培养皿中。测定中以〇. 2%DMS0为阴性对照，以30μ g/mL的甲霜灵为阳性对照。经过16-24h的避光培养，在光学显微镜下观察疫霉菌无性孢子 囊产生的情况并悬浮计数(10倍目镜，4倍物镜)统计，然后计算其抑制率。
[0042] 抑制率（％) = (Nd-Ns)/NcX100%
[0043] Nd:阴性对照组单位体积内产生的无性孢子囊数;Ns:样品组单位体积内产生的无 性孢子囊数。
[0044] 2.实验结果：
[0045] 在3yg/mL浓度下的黄酮苷类混合物A2和B2对疫霉菌无性孢子囊产生的抑制率分 别为88%和98% (图1)。五个黄酮苷化合物分别在3(^11、3(^1、3以1、3以1、1(^1的浓度下对疫 霉菌无性孢子囊产生的抑制率为74%、65%、86%、78%、90% (图2)及相应的显微图片（图 3)〇
【主权项】
1. 一种头花寥中黄酮苷活性组分，该组分主要包含五个黄酮苷化合物，其特征在于，所 述头花寥中黄酮苷活性组分通过以下步骤制备获得： (1) 粉碎和浸提： 将头花寥粉碎后，用工业级甲醇溶液在室温下浸提2次，每次1天，抽滤浓缩，得甲醇浸 提物粗样，用乙酸乙酯和水萃取分离，静置，将乙酸乙酯层减压浓缩旋干后，得到乙酸乙酯 层粗样； (2) 分离和纯化： 将乙酸乙酯层粗样先经硅胶开口柱分离，分离条件:200-300目，溶剂系统为正己烷:二 氯甲烷、二氯甲烷：乙酸乙酯和甲醇，再进一步通过十八烷基键合硅胶开口柱分离，溶剂系 统为甲醇：水，在洗脱体系分别为40 %甲醇水溶液和50 %甲醇水溶液时得到两个黄酮苷活 性组分，两个黄酮苷活性组分再分别经十八烷基键合硅胶开口柱分离，溶剂系统为甲醇： 水，得到较纯的黄酮苷活性组分，然后再分别用反相HPLC纯化，流动相为甲醇水溶液，最终 得到五个黄酮苷化合物；五个化合物分别是myricetin 7-〇-a-L-rhamnopyranoside， quercetin 3-Ο-β-D-g1ucopyranoside，quercetin 4'-〇-a-L_rhamnopyranoside， quercetin 3_〇-a-(2''-galloyl)rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside〇2. 根据权利要求1所述的一种头花寥中黄酮苷活性组分，其特征在于，所述步骤(2)中 正己烷:二氯甲烷溶剂系统按体积比为：100:0，90:10，70:30，50:50,30:70,10:90，0:100; 随后二氯甲烷：乙酸乙酯溶剂系统按体积比为:90:10，70:30，50:50，30:70，0:100;最后为 甲醇。3. 根据权利要求1所述的一种头花寥中黄酮苷活性组分，其特征在于，步骤(2)中第一 次十八烷基键合硅胶开口柱纯化的甲醇:水溶剂系统按体积比为:30:70，35:65，40:60，50: 50,60:40,70:30,90:10，100:0。4. 根据权利要求1所述的一种头花寥中黄酮苷活性组分，其特征在于，步骤(2)中第二 次十八烷基键合硅胶开口柱纯化的甲醇:水溶剂系统按体积比分别为:30:70，50: 50和30: 70,35:65,60:40。5. 根据权利要求1所述的一种头花寥中黄酮苷活性组分，其特征在于，步骤(2)中HPLC 纯化的色谱柱和流动相分别为CAPCELL PAKC18,甲醇：水= 38:62和Develosil C30-UG-5， 甲醇：水= 48:52。6. 根据权利要求1所述的一种头花寥中黄酮苷活性组分在制备抗疫霉菌农药中的应 用，所述黄酮苷活性组分主要包括五个黄酮苷化合物。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物是以黄酮苷活性组分或五个黄酮 苷化合物为活性成份，与药学上可接受的载体或赋形剂制得。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物剂型选用固体制剂或液体制剂。
【文档编号】A01P3/00GK106046081SQ201610408978
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】戚建华, 张慧, 王倩, 王源超
【申请人】浙江大学