专利名称：全合成苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程的荧光假单胞工程菌(pseudomonas fluorescens)，更具体地说全合成苏云金杆菌杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因。
苏云金杆菌(Bacitlus thuringiensis简称Bt)是国内外最重要的生物杀虫剂，它产生的晶体蛋白对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫具杀伤活性，而对人畜无害。Bt蛋白在田间易分解，对环境的污染小，另外，害虫对Bt产生抗性的过程明显长于化学农药。从人类可持续发展的角度考虑，Bt杀虫剂将把化学杀虫剂慢慢排挤出去。迄今全世界已有100多种Bt产品进入市场，年销售额超过1亿美元。这些产品被广泛地应用于农业及林业害虫的防治。
国内外大多数Bt产品来自于天然的苏云金杆菌，不同的菌株杀虫谱存在较大差异，杀虫毒力相差很大。分离菌株对害虫的杀虫谱含扩了鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、食毛目和蜱螨目等，它们分别代表45种不同的血清型。到目前为止，从这些Bt中发现100多个cry基因，根据cry蛋白的氨基酸顺序关联性，这些基因分成了17个大组。苏云金杆菌可以从土壤、植物表面以及昆虫体内分离得到，但是筛选高毒力、杀虫谱广的苏云金杆菌需要投入大量的人力和物力；此外由于苏云金杆菌发酵条件要求严格，发酵密度很难提高；再加上细菌发酵形成芽孢过程中，容易导致菌体自溶，产品不稳定。随着Bt产品市场需求越来越大，传统Bt产品已不能适应生产需要。
重组DNA技术为构建新的cry基因提供了更大的灵活性，利用基因工程技术能够克隆单独的cry基因，还可以通过改变cry基因的调控序列来提高杀虫蛋白的表达量。
许多实验室构建的载体质粒已广泛应用到cry基因的克隆与表达中。这些种类和数目繁多的各类cry基因表达载体已经转化到Bt(Takashi，1993；Bruce，1993杀虫工程进展)、大肠杆菌(范云六，1991，科学通报)、农杆菌(郭三堆，1991，生物工程学报)、枯草芽孢杆菌(余学政，1990，生物工程学报)，巨大芽孢杆菌(Bora，1994，应用和环境微生物学)、蜡仗芽孢杆菌(Moar，1994，应用和环境微生物学)以及各种植物组织中(谢道晰，1991，中国科学)，美国的作物遗传研究所甚至把克隆的Bt毒蛋白基因导入作物内生菌中，但是这些工程菌还很难推向市场，其中有以下原因(1)来自苏云金杆菌的Bt毒蛋白基因在不同的宿主菌中表达量很低，需要大剂量的细菌才能起到防虫杀虫效果；(2)包括大肠杆菌在内的很多细菌含有内毒素，对人体有害，如果Bt毒蛋白作为粗制产品使用，具有极大的危害，如果作为纯化产品使用，将大大提高成本；(3)Bt毒蛋白基因如果在细菌或植物细胞中组成型表达，田间释放后对环境将构成很大的压力，抗虫蛋白功能极容易丢失。
在国内，有多家研究机构进行了Bt基因的克隆和原核表达载体的构建工作。刘子铎等利用广宿主质粒pSUP106将Bt基因转化到荧火假单胞菌中，通过SDS-PAGE分析，可以检测Bt基因的表达，中国农科院张光炳等利用Tn5转座子将Bt基因转化到荧光假单胞菌染色体上，Westernblotting检测出Bt基因表达。但这些研究思路都不成熟，(1)直接利用苏云金杆菌的野生型基因，影响了基因的转录和翻译；(2)都采用组成型表达，发酵密度不高；(3)拷贝数低，难以实现高表达；(4)只能用死菌防止害虫。研究不够深入从而影响其应用价值。
本发明目的全合成适合荧光假单胞工程菌高表达杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因。
本发明另一目的利用全合成高表达杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因用于生物防治。
本发明采用荧光假单胞菌作为Bt基因表达的宿主菌，根据荧光假单胞菌的偏爱密码全合成1.8kb CryIA(c)Bt基因。
CryIA(c)Bt基因合成采用重叠延伸PCR方法，结合高保真的PWO耐高温DNA聚合酶进行PCR扩增。分两段进行合成，第一段从ATG起始密码到1424PstI位点(Bio/technology，1990，8939-943)，共有1429bp核苷酸；第二段从1424PstI位点到终止密码TGA，共有424bp核苷酸。利用T4连接酶将合成片段在PstI位点连接成完整的基因。合成基因与野生型基因相比，核苷酸的同源性仅为66.8％；616个密码子中有496个密码子核苷酸改变；整个基因的核苷酸组成发生了变化，增加了结构稳定的碱基含量，其中G+C的含量由37.2％提高到64％；mRNA不稳定的AT核苷酸积聚区域序列全部替换；并改动了4个易形成二级发卡结构区域核苷酸序列，291-304 TTCTAGATTAGAA；441-465TTTGCAGTTCAAAATTATCAATTT；622-633 GTACGCTGGT AC；1039-1054CAACAACGTATTGTTG。
全合成CryIA(c)Bt(BT1)基因核苷酸序列如下BTI - ATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACC -55BTI - CGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGA -110BTI - CATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGC -165BTI - TTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGG -220BTI - ACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGC -275BTI - CCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTAC -330BTI - GCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAG -385BTI - AAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCT -440BTI - GTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGCGTGTACGTGCAGGCCGCC -495BTI - AACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCT -550BTI - TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA -605BTI - CTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGT -660BTI - CCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGA -715BTI - CCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGAT -770BTI - CCGCACCGTGAGCCAGCTGACCCGCGAAATCTACACCAACCCGGTGCTGGAAAAC -825BTI- TTCGACGGCAGCTTCCGCGGCAGCGCCCAGGGCATCGAAGGCAGCATCCGCAGCC -880BTI- CGCACCTGATGGACATCGTGAACAGCATCACCATCTACACCGACGCCCACCGCGG -935BTI- CGAATACTACTGGAGCGGCCACCAGATCATGGCCAGCCCGGTGGGCTTCAGCGGC -990BTI- CCGGAGTTCACCTTCCCGCTGTACGGCACGATGGGCAACGCCGCCCCGCAGCAGC -1045BTI- GCATCGTGGCCCAGCTGGGCCAGGGCGTGTACCGCACCCTGAGCAGCACCCTGTA -1100BTI- CCGCCGCCCGTTCAACATCGGCATCAACAACCAGCAGCTGAGCGTGCTGGACGGC -1155BTI- ACCGAGTTCGCCTACGGCACCAGCAGCAACCTGCCGAGCGCCGTGTACCGCAAGA -1210BTI- GCGGCACCCTGGACAGCCTGGACGAAATCCCGCCGCAGAACAACAACGTGCCGCC -1265BTI- GCGCCAGGGCTTCAGCCACCGCCTGAGCCACGTGAGCATGTTCCGCAGCGGCTTC -1320BTI- AGCAACACCAGCGTGAGCATCATCCGCGCCCCGATGTTCAGCTGGATTCACCGCA -1375BTI- GCGCCGAGTTCAACAACATCATCGCCAGCGACAGCATCACCCAGATCCCTGCAGT -1430BTI- GAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC -1485BTI- GGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACA -1540BTI- TCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCG -1595BTI- CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATC -1650BTI- TTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCG -1705BTI- ACTTCGGCTACTTCGAAAGCGCCAACGCCTTCACCAGCAGCCTGGGCAACATCGT -1760BTI- GGGCGTGCGCAACTTCAGCGGCACCGCCGGCGTGATCATCGACCGCTTCGAGTTC -1815BTI- ATCCCGGTGACGGCCACCCTGGAAGCCGAATGA -1848全合成CryIA(c)Bt(BT1)基因和野生型基因(BT)核苷酸序列比较。两基因的同源性为66.8％，616个密码子中有496个密码子核苷酸改变，以适应荧光假单胞菌中翻译表达。改动了4个易形成二级发卡结构区域核苷酸序列，291-304 TTCTAGATTAGAA；441-465TTTGCAGTTCAAAATTATCAATTT；622-633 GTACGCTGGT AC；1039-1054 CAACAACGTATTGTTG。改动了23个富含AT的区域。36-43TTATAATT；110-115 ATATTT；185-193 ATATAATAT；198-204 AATTTTT；247-254 TTAATTAA；323-329 AAATTTA；470-475 TTTTAT；495-508AAATTTACATTTAT；566-579 TTATAATGATTTAA；683-696ATATAATCAATTTA；703-708 AATTAA；785-793 AATTAACA 798-809AAATTTATACAAA；815-825 TATTATGAAAT；938-946 AATATTATT；960-966 AAATAAT；1110-1132 TTTTAATATAGGGATAAATAAT；1382-1398 AATTTAATAATATAATT；1441-1452 TTTCTTTTTAATT；1496-1507 TTAGATTAAATA；1515-1524 AAATAACATT；1706-1719ATTTTGGTTATTTT；1752-1758 TAATATA；1770-1777 AAATTTTA；1811-1816 AATTTATT人工全合成CryIA(c)Bt(BT1)基因和野生型基因(BT)核苷酸序列比较如下BT- ATGGATAACAATCCGAACATCAATGAATGGATTCCTTATAATTGTTTAAGTAACC -55BTI - ATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACC -55BT- CTGAAGTAGAAGTATTAGGTGGAGAAAGAATAGAAACTGGTTACACCCCAATCGA -110BTI - CGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGA -110BT- TATTTCCTTGTCGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTGAATTTGTTCCCGGTGCTGGA -165BTI - CATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGC -165BT- TTTGTGTTAGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTTTTGGTCCCTCTCAATGGG -220BTI - TTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGG -220BT- ACGCATTTCTTGTACAAATTGAACAGTTAATTAACCAAAGAATAGAAGAATTCGC -275BTI - ACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGC -275BT- TAGGAACCAAGCCATTTCTAGATTAGAAGGACTAAGCAATCTTTATCAAATTTAC -330BTI - CCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTAC -330BT- GCAGAATCTTTTAGAGAGTGGGAAGCAGATCCTACTAATCCAGCATTAAGAGAAG -385BTI - GCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAG -385BT- AGATGCGTATTCAATTCAATGACATGAACAGTGCCCTTACAACCGCTATTCCTCT -440BTI - AAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCT -440BT- TTTTGCAGTTCAAAATTATCAATTTCCTCTTTTATCAGTATATGTTCAAGCTGCA -495BTI - GTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGCGTGTACGTGCAGGCCGCC -495BT- AATTTACATTTATCAGTTTTGAGAGATGTTTCAGTGTTTGGACAAAGGTGGGGAT -550BTI - AACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCT -550BT- TTGATGCCGCGACTATCAATAGTCGTTATAATGATTTAACTAGGCTTATTGGCAA -605BTI - TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA -605BT- CTATACAGATCATGCTGTACGCTGGTACAATACGGGATTAGAGCGTGTATGGGGA -560BTI - CTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGT -660BT- CCGGATTCTAGAGATTGGATAAGATATAATCAATTTAGAAGAGAATTAACACTAA -715BTI - CCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGA -715BT- CTGTATTAGATATCGTTTCTCTATTTCCGAACTATGATAGTAGAACGTATCCAAT -770BTI - CCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGAT -770BT- TCGAACAGTTTCCCAATTAACAAGAGAAATTTATACAAACCCAGTATTAGAAAAT -825BTI - CCGCACCGTGAGCCAGCTGACCCGCGAAATCTACACCAACCCGGTGCTGGAAAAC -825BT- TTTGATGGTAGTTTTCGAGGCTCGGCTCAGGGCATAGAAGGAAGTATTAGGAGTC -880BTI - TTCGACGGCAGCTTCCGCGGCAGCGCCCAGGGCATCGAAGGCAGCATCCGCAGCC -880BT- CACATTTGATGGATATAGTGAATAGTATAACCATCTATACGGATGCTCATAGAGG -935BTI - CGCACCTGATGGACATCGTGAACAGCATCACCATCTACACCGACGCCCACCGCGG -935BT - AGAATATTATTGGTCAGGGCATCAAATAATGGCTTCTCCTGTAGGGTTTTCGGGG -990BTI - CGAATACTACTGGAGCGGCCACCAGATCATGGCCAGCCCGGTGGGCTTCAGCGGC -990BT - CCAGAATTCACTTTTCCGCTATATGGAACTATGGGAAATGCAGCTCCACAACAAC -1045BTI - CCGGAGTTCACCTTCCCGCTGTACGGCACGATGGGCAACGCCGCCCCGCAGCAGC -1045BT - GTATTGTTGCTCAACTAGGTCAGGGCGTGTATAGAACATTATCGTCCACCTTATA -1100BTI - GCATCGTGGCCCAGCTGGGCCAGGGCGTGTACCGCACCCTGAGCAGCACCCTGTA -1100BT - TAGAAGACCTTTTAATATAGGGATAAATAATCAACAACTATCTGTTCTTGACGGG -1155BTI - CCGCCGCCCGTTCAACATCGGCATCAACAACCAGCAGCTGAGCGTGCTGGACGGC -1155BT - ACAGAATTTGCTTATGGAACCTCCTCAAATTTGCCATCCGCTGTATACAGAAAAA -1210BTI - ACCGAGTTCGCCTACGGCACCAGCAGCAACCTGCCGAGCGCCGTGTACCGCAAGA -1210BT - GCGGAACGCTAGATTCGCTGGATGAAATACCGCCACAGAATAACAATGTGCCACC -1265BTI - GCGGCACCCTGGACAGCCTGGACGAAATCCCGCCGCAGAACAACAACGTGCCGCC -1265BT - TAGGCAAGGATTTAGTCATCGATTAAGCCATGTTTCAATGTTTCGTTCAGGCTTT -1320BTI - GCGCCAGGGCTTCAGCCACCGCCTGAGCCACGTGAGCATGTTCCGCAGCGGCTTC -1320BT - AGTAATACTAGTGTAAGTATAATAAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTA -1375BTI - AGCAACACCAGCGTGAGCATCATCCGCGCCCCGATGTTCAGCTGGATTCACCGCA -1375BT - GTGCTGAATTTAATAATATAATTGCATCGGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGT -1430BTI - GCGCCGAGTTCAACAACATCATCGCCAGCGACAGCATCACCCAGATCCCTGCAGT -1430BT - GAAGGGAAACTTTCTTTTTAATGGTTCTGTAATTTCAGGACCAGGATTTACTGGT -1485BTI - GAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC -1485BT - GGGGACTTAGTTAGATTAAATAGTAGTGGAAATAACATTCAGAATAGAGGGTATA -1540BTI - GGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACA -1540BT - TTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATATCGACTTCGTGTACG -1595BTI - TCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCG -1595BT - GTATGCTTCTGTAACCCCGATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAATTCATCCATT -1650BTI - CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATC -1650BT - TTTTCCAATACAGTACCAGCTACAGCTACGTCATTAGATAATCTACAATCAAGTG -1705BTI - TTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCG -1705BT - ATTTTGGTTATTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCATTAGGTAATATAGT -1760BTI - ACTTCGGCTACTTCGAAAGCGCCAACGCCTTCACCAGCAGCCTGGGCAACATCGT -1760BT - AGGTGTTAGAAATTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATAATAGACAGATTTGAATTT -1815BTI - GGGCGTGCGCAACTTCAGCGGCACCGCCGGCGTGATCATCGACCGCTTCGAGTTC -1815BT - ATTCCAGTTACTGCAACACTCGAGGCTGAATGA -1848BTI - ATCCCGGTGACGGCCACCCTGGAAGCCGAATGA -1848利用荧光假单胞菌作为Bt基因表达的宿主菌有很多优点(1)发酵时间仅为苏云金杆菌的1/3，培养基成份简单，因此发酵成本降低且可明显减少杂菌及噬菌体污染。(2)发酵菌体密度可望提高，而菌体的毒力单位相近。(3)由于苏云金杆菌在产生晶体蛋白的同时产生菌体的自溶，故传统发酵产品稳定性差，不易储存，且杀虫有效期仅持续2-3天。而荧光假单胞菌发酵后不溶菌，菌体的胞壁成为毒蛋白的保护层，便于储存，且杀虫有效期可延长至12天。(4)荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是植物根际和叶围微生物的主要类群，一方面能够在植物表面定植，另一方面能够对其它有害病原菌产生拮抗作用，起到防病抗虫的双重效果。
实施例1CryIA(c)Bt基因的全合成1、全合成60-90 bq长的寡核苷酸2、利用PWO taq DNA聚合酶将寡核苷酸片段连接
图1连续延伸PCR合成CryIA(c)Bt基因。引物长度为60-90bp.每个引物间有20-30 bp左右重叠。将所有引物加入后进行PCR扩增，中间引物用量为10-20ng，两边引物用量为100-200ng。PCR扩增条件为94℃，30 s；65℃，30 s；72℃，2min。共进行35个循环。分两段进行PCR扩增第一段从ATG起始密码到1424 PstI位点，共有1429 bp核苷酸第一段的引物为BT1AGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGACCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGATCCGCACCGTGBT2ACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGTCCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGABT3GCCGTCGAAGTTTTCCAGCACCGGGTTGGTGTAGATTTCGCGGGTCAGCTGGCTCACGGTGCGGATCGGGTAGGTGCGGCTGTBT4TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGBT5TGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCAGGTGCGGGCTGCGGATGCTGCCTTCGATGCCCTGGGCGCTGCCGCGGAAGCTGCCGTCGAAGTTTTCCBT6CGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA CTACACCGACCACGCCGTBT7GCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATCTGGTGGCCGCTCCAGTAGTATTCGCCGCGGTGGGCGTCGGTGTAGATGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCBT8GAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCBT9CGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGATGCGCTGCTGCGGGGCGGCGTTGCCCATCGTGCCGTACTGCGGGAAGGGAACTCCGGGCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATBT10CTGACCACCGCCATCCCGCTGTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGGTGTACGTGCAGGCCGCCAACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTBT11TCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCTGCTGGTTGTTGATGCCGATGTTGAACGGGCGGCGGTACAGGGTGCGGTSCACGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGABT12GAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAGAAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCTBT13TGCGGCGGGATTTCGTCCAGGCTGTCCAGGGTGCCGCTCTTGCGGTACTCGGCGCTCGGCAGGTTGCTGCTGGTGCCGTAGGCGAACTCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCBT14AGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGCCCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTACGCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGBT15CGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCGGAACATGCTCACGTGGCTCAGGCGGTGGCAGCCTGGCTGAAGCCCTGGCGCGGCGGCACGTTGTTGTTCTGCGGCGGGATTTCGTBT16CGCCGGCTTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGGACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGBT17GATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCAGCTGAACATCGGGGCGCCGGAYGATGCTCACGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCBT18GCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGACATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGCTTCGTGCTGGGCCBT19ACTGCAGGGATCTGGGTGATGCTGTCGCTGGCGATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCBT20ACGGATCCATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACCCGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTA第二段从1424 PstI位点到终止密码TGA，共有424 bp核苷酸BT21CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATCTTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCGBT22CCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCGCTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACBT23TGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCCACGATGTTGCCCAGGCTGCTGGTGAAGGCGTTGGCGCTTTCGAAGTAGCCGAAGTCGCTGTGTGGAGGTTGTCCAGGCTGGTGBT24GATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGCGGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATBT25AAGAGCTCTCATTCGGCTTCCAGGGTGGCCGTCACCGGGATGAACTCGAAGCGGTCGATGATCACGCCGGCGGTGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCBT26GATCCCTGCAGTGAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC将两个片段用T4DNA连接酶相连实施例2CryIA(c)Bt在大肠杆菌中表达图2大肠杆菌产生苏云金杆菌δ-内毒素的SDS-PAGE图谱实施例3大肠杆菌表达CryIA(c)蛋白的生物活性测定收集带CryIA(c)表达载体的大肠杆菌菌体和空载菌各50ml，用20ml的重蒸水悬浮，超声波处理后，按10倍梯度稀释，分别涂抹于16cm2的甘蓝叶片上，烘干后饲喂三龄菜青虫，对照组以空载菌蛋白粗提液替代。喂食4天后观察，100倍稀释液对菜青虫的致死率为93.3％(表1)。
表1大肠杆菌表达的CryIA(c)对菜青虫的毒杀效果处理 活虫数 死虫数(％)1 2 3对照(PUT56)20 20 20 0大肠肝菌稀释液1∶1 0 0 0 1001∶10 0 1 0 98.31∶100 2 1 1 93.3实施例4全合成CryIA(c)基因荧光假单胞菌中表达图3荧光假单胞菌中CryIA(c)基因表达产物的SDS-PAGE分析实施例5荧光假单胞工程菌杀虫活性测定二龄菜青虫的毒杀实验表明，工程菌蛋白抽提液800倍稀释后对幼虫的致死率为40％，测定LD50为0.028μg/cm2(表2)。
表2.荧光假单胞菌表达产物的生物测定
权利要求
1.一种苏云金杆菌杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因，它的核苷酸序列如下BTI -ATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACC -55BTI -CGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGA -110BTI -CATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGC -165BTI -TTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGG -220BTI -ACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGC -275BTI -CCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTAC -330BTI -GCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAG -385BTI -AAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCT -440BTI -GTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGCGTGTACGTGCAGGCCGCC -495BTI -AACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCT -550BTI -TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA -605BTI -CTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGT -660BTI -CCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGA -715BTI -CCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGAT -770BTI -CCGCACCGTGAGCCAGCTGACCCGCGAAATCTACACCAACCCGGTGCTGGAAAAC -825BTI -TTCGACGGCAGCTTCCGCGGCAGCGCCCAGGGCATCGAAGGCAGCATCCGCAGCC -880BTI -CGCACCTGATGGACATCGTGAACAGCATCACCATCTACACCGACGCCCACCGCGG -935BTI -CGAATACTACTGGAGCGGCCACCAGATCATGGCCAGCCCGGTGGGCTTCAGCGGC -990BTI -CCGGAGTTCACCTTCCCGCTGTACGGCACGATGGGCAACGCCGCCCCGCAGCAGC -1045BTI -GCATCGTGGCCCAGCTGGGCCAGGGCGTGTACCGCACCCTGAGCAGCACCCTGTA -1100BTI -CCGCCGCCCGTTCAACATCGGCATCAACAACCAGCAGCTGAGCGTGCTGGACGGC -1155BTI -ACCGAGTTCGCCTACGGCACCAGCAGCAACCTGCCGAGCGCCGTGTACCGCAAGA -1210BTI -GCGGCACCCTGGACAGCCTGGACGAAATCCCGCCGCAGAACAACAACGTGCCGCC -1265BTI -GCGCCAGGGCTTCAGCCACCGCCTGAGCCACGTGAGCATGTTCCGCAGCGGCTTC -1320BTI -AGCAACACCAGCGTGAGCATCATCCGCGCCCCGATGTTCAGCTGGATTCACCGCA -1375BTI -GCGCCGAGTTCAACAACATCATCGCCAGCGACAGCATCACCCAGATCCCTGCAGT -1430BTI -GAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC -1485BTI -GGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACA -1540BTI -TCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCG -1595BTI -CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATC -1650BTI -TTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCG -1705BTI -ACTTCGGCTACTTCGAAAGCGCCAACGCCTTCACCAGCAGCCTGGGCAACATCGT -1760BTI -GGGCGTGCGCAACTTCAGCGGCACCGCCGGCGTGATCATCGACCGCTTCGAGTTC -1815BTI -ATCCCGGTGACGGCCACCCTGGAAGCCGAATGA -1848
2.根据权利要求1所述的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因，其特征在于Bt基因表达的宿主菌是荧光假单胞菌。
3.根据权利要求1所述的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因，其特征在于四个易形成二级发卡结构区域被消除，这四个区域的核苷酸序列如下291-304 TTCTAGATTAGAA；441-465 TTTGCAGTTCAAAATTATCAATTT；622-633GTACGCTGGT AC；1039-1054 CAACAACGTATTGTTG。
4.一种苏云金杆菌杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因的制备方法，其特征在于分两段进行合成，第一段从ATG起始密码到1424 PstI位点，共有1429bp核苷酸，第二段从1424 PstI位点到终止密码TGA，共有424 bp核苷酸，再用T4连接酶将第一段和第二段在PstI位点连接而得。
5.根据权利要求4所述的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因的制备方法，其特征在于引物长度为60-90 bp左右每个引物间有20-30bp左右重叠，将所有引物加入后进行PCR扩增，中间引物用量为10-20ng，两边引物用量为100-200ng。
6.根据权利要求5所述的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因的制备方法，其特征在于第一段合成引物为BT1AGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGACCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGATCCGCACCGTGBT2ACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGTCCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGABT3GCCGTCGAAGTTTTCCAGCACCGGGTTGGTGTAGATTTCGCGGGTCAGCTGGCTCACGGTGCGGATCGGGTAGGTGCGGCTGTBT4TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGBT5TGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCAGGTGCGGGCTGCGGATGCTGCCTTCGATGCCCTGGGCGCTGCCGCGGAAGCTGCCGTCGAAGTTTTCCBT6CGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCACGCCGTBT7GCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATCTGGTGGCCGCTCCAGTAGTATTCGCCGCGGTGGGCGTCGGTGTAGATGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCBT8GAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCBT9CGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGATGCGCTGCTGCGGGGCGGCGTTGCCCATCGTGCCGTACTGCGGGAAGGGAACTCCGGGCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATBT10CTGACCACCGCCATCCCGCTGTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGGTGTACGTGCAGGCCGCCAACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTBT11TCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCTGCTGGTTGTTGATGCCGATGTTGAACGGGCGGCGGTACAGGGTGCGGTSCACGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGABT12GAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAGAAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCTBT13TGCGGCGGGATTTCGTCCAGGCTGTCCAGGGTGCCGCTCTTGCGGTACTCGGCGCTCGGCAGGTTGCTGCTGGTGCCGTAGGCGAACTCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCBT14AGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGCCCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTACGCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGBT15CGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCGGAACATGCTCACGTGGCTCAGGCGGTGGCAGCCTGGCTGAAGCCCTGGCGCGGCGGCACGTTGTTGTTCTGCGGCGGGATTTCGTBT16CGCCGGCTTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGGACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGBT17GATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCAGCTGAACATCGGGGCGCCGGAYGATGCTCACGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCBT18GCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGACATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGCTTCGTGCTGGGCCBT19ACTGCAGGGATCTGGGTGATGCTGTCGCTGGCGATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCBT20ACGGATCCATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACCCGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTA第二段合成引物为BT21CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATCTTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCGBT22CCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCGCTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACBT23TGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCCACGATGTTGCCCAGGCTGCTGGTGAAGGCGTTGGCGCTTTCGAAGTAGCCGAAGTCGCTGTGTGGAGGTTGTCCAGGCTGGTGBT24GATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGCGGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATBT25AAGAGCTCTCATTCGGCTTCCAGGGTGGCCGTCACCGGGATGAACTCGAAGCGGTCGATGATCACGCCGGCGGTGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCBT26GATCCCTGCAGTGAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC
7.根据权利要求4所述的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因的制备方法，其特征在于PCR扩增条件为94℃，30秒；65℃，30秒；72℃，2分钟共进行35个循环。
8.一种苏云金杆菌杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因，具有生物活性可用作杀虫剂。
9.根据权利要求8所述的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因，其特征在于对鳞翅目昆虫有效。
全文摘要
本发明提供全合成适合荧光假单胞工程菌高表达杀虫晶体蛋白CryIA(c)Bt基因,采用重叠延伸PCR方法,结合高保真的PWO耐高温DNA聚合酶进行PCR扩增,分两段进行全合成及其在生物防治中作为杀虫剂特别对鳞翅目昆虫有效。
文档编号A01N63/00GK1340614SQ0011975
公开日2002年3月20日 申请日期2000年8月25日 优先权日2000年8月25日
发明者姚泉洪, 彭日荷, 熊爱生 申请人:上海市农业科学院生物技术研究中心