专利名称：以玻璃珠为培养基质的丛枝菌根真菌的培养的制作方法
技术领域：
本发明涉及特殊微生物的培养技术，更具体地说涉及丛枝菌根真菌的培养，以及特定的培养装置及培养介质。
丛枝菌根(AM)在农业生产实践和自然生态系统中的重要作用已广为人们所知。近85％的植物种类和几乎所有的农作物能够形成丛枝菌根。丛枝菌根真菌(AMF)可以通过多种方式或途径影响植物的生理代谢和生长发育过程。许多调查研究表明丛枝菌根对植物的营养状况(尤其是植物的磷营养)、水分的吸收利用、抵抗病原菌侵染、盐分及重金属毒害有着显著的积极的作用。在资源和环境问题日益严峻的背景下，丛枝菌根的应用作为一条有效可行的生物学途径，能够发掘生物的自身潜力，提高作物对自然资源的利用效率，从而降低能耗，减轻环境所承受的压力，因而有着广阔的应用前景。对丛枝菌根研究和认识日趋广泛深入的同时，在应用方面，出现了商业化接种剂。然而，AM真菌是严格专性共生生物，脱离了宿主植物即无法正常生长发育，完成生命过程。虽然研究者们试图探明宿主植物与菌根真菌之间的信息和物质交换过程，但至今不能获取足够的数据以支撑建立AM真菌的离体培养，这无疑成为相关研究以及丛枝菌根广泛应用的主要障碍。
无论出于科学还是经济的考虑，获得AM真菌材料都有着极其重要的意义。对丛枝菌根进行遗传学和生物学的研究有赖于获得纯净真菌组织，而生产商业化的接种剂需要高密度和纯度的真菌繁殖体。显然，现有条件下只能建立共生条件下的AM真菌培养。通常应用的培养方法包括土培、无土基质培养(如沙培)等，也有稀少的应用雾培或营养液培养的报道。双重无菌培养技术是近年来发展起来的一种最接近于纯培养的AM真菌培养技术。在这种培养体系中，菌根共生体由Ri T-DNA转基因的宿主植物根器官和菌根真菌在培养基中建立起来，由此丛枝菌根由开放式培养系统转入微生物实验室的培养皿中，从而尽可能地减免了外源污染。一些商业行为和科研活动中，各种生长刺激物质(如类异黄酮、褐藻酸低聚糖等)被应用以促进真菌孢子产生及菌丝体发育。偶有商家或研究者称人工混合基质中离体真菌孢子和菌丝体的富集培养为纯培养(大多应用了生长刺激或促进物质)，但并非科学上的纯培养概念。
基质培养(如土培)易于操作，成功率高，所以仍是当前应用最为广泛的AM真菌培养方法，但开放式培养过程中菌种会遭受不同程度的外源污染，经过数代培养菌种往往严重蜕化，于是不得不重新纯化。如果需要从土壤盆栽宿主植物分离AM真菌，去除孢子表面的污染显得十分困难，同时也难以获得足够量的纯净菌丝体。少见应用的无土培养技术(如雾培、营养液膜培养)因为难以维系适宜的生长条件，成功率和培养效率通常不高。利用双重无菌培养技术获得的真菌孢子很有价值，然而建立此培养体系极其繁琐，培养条件要求严格，非专业技术人员难以操作，而且目前只有少数几个真菌菌种建立了这种培养。
无可否认，通过基质培养途径提供菌剂是简便可行的，但为了某些特殊目的需要获得大量纯净真菌材料，如科学研究的需要以及生产高纯度的商业化菌剂，通常的培养方法便显出无以克服的局限性，普遍的困难是无法简单有效地将宿主植物根系和培养基质与真菌分离。对于无土培养，即便不考虑其它局限性，也面临着同样的问题。针对这些困难，我们在此提出一种玻璃珠分室培养技术以弥补现有AM真菌培养技术的不足。
本发明的目的之一是提供一种新的从枝菌根(AM)真菌的培养方法，该方法应用特殊培养装置和培养介质，区隔真菌和宿主植物的生长空间，有效免除植物生长基质及外物对真菌的可能污染。
本发明的技术方案如下1.培养装置采用硬质塑料板(或有机玻璃板、PVC板等)与特殊孔径的尼龙网加工成三分室的培养容器(附
图1)。三个分室中，中间的分室为区隔宿主植物与真菌生长空间的隔离分室。区隔分室与植物生长室之间以1mm孔径的尼龙网分隔，与真菌生长室之间以30μm尼龙网分隔。根系可以穿过1mm尼龙网生长到区隔分室中，但30μm尼龙网只允许根外菌丝通过而阻止了根系的伸展，所以只有菌根真菌能够在玻璃珠分室中生长。区隔分室中填充粗河砂可以有效防止植物生长室中土壤颗粒对真菌的污染，而真菌生长室中的玻璃珠因具有表面光滑、比重相对较重的特性而易于和真菌组织分离。区隔分室和真菌生长室盖上尺寸合适的深色PVC板盖子以避免外源污染(如藻类生长)。
2.培养程序
(1)基本材料准备A、宿主植物(如玉米、三叶草等)种子；菌根接种剂为含有真菌孢子和菌丝体的菌土，或其它类型菌剂)；B、3～4mm厚的有机玻璃板或PVC板；网孔分别为1mm和30μm的尼龙网；C、低养分含量的沙土与沙子；粗河砂(粒径1～3mm)；玻璃珠(粒径0.8～1.2mm)。
植物种子需经表面消毒，所有培养基质均需灭菌处理(如高压蒸汽灭菌)。
(2)培养系统的建立如前所述，培养容器由塑料板或有机玻璃板和尼龙网加工而成。分别将粗河砂和玻璃珠装入区隔分室和真菌生长室，菌根接种剂(接种剂量一般为生长基质总量的5％)与沙土混匀装入植物生长室，而后自区隔室浇水(使植物生长室中重量含水量在15％左右)，待水分渗透均匀后播种。
A、培养基质前述特定粒径的玻璃珠(0.8～2.0mm)和河砂(1～3mm)；B、培养装置三室培养系统，或者为提高培养效率在植物生长室另一侧增加一个区隔室和真菌生长室，或在真菌生长室另一侧增加一个区隔室和植物生长室而构成五室培养系统；特定网孔(1mm和30μm)的尼龙网；C、真菌菌种Glomus mosseae、Glomus versiforme、Glomus
intraridices、Sclerocystis sinuosa、Gigarspora margarita等。
(3)培养过程在能够控制温度和光照的培养室中进行培养。水分管理注意只能从区隔室浇水，以防止土壤颗粒被冲入中间分室污染真菌。平时用盖子盖住区隔室和真菌生长室以防止水分过度蒸发及藻类生长。当植物出现缺素症状时，向菌根室浇入1/4 Hoagland营养液(Hoagland& Snyder，1938，其中P浓度降低至1/10)。培养过程中可随时用小茶匙自真菌生长室取样，观测是否有菌丝及孢子产生。
收获一般培养周期为8周左右。最后收获时，用茶匙将真菌生长室内的真菌连同玻璃珠转移到380μm筛上，用蒸馏水小心冲洗，通过30μm筛回收菌体。也可以将真菌连同玻璃珠缓缓倾入盛有蒸馏水的塑料杯中，玻璃珠很快沉入杯底，而菌丝体及孢子浮留于水面，通过30μm筛可回收菌物。
我们由宿主植物三叶草、玉米和AM真菌菌种Glomus mosseae、Glomus versiforme、Glomus intraridices、Sclerocystis sinuosa、Gigarspora margarita等在玻璃珠分室培养系统中成功建立了菌根共生培养，并获得了相应纯净真菌。对于产孢能力强的真菌菌种Glomusversiforme来说，由体积为(10×15×(3+4+5))cm3的培养容器可获得多至20毫克干重的菌体，每盆获取孢子数量可以万计。
玻璃珠分室培养将AM真菌的传统基质培养与无土培养完好结合起来，简便易行，培养效率却大大提高。这种培养系统最显著的优点是真菌易于和培养基质分离。利用这种培养技术可以培养出大量保持自然菌落的AM真菌，同时免除其它外源污染，无论对于科学研究或是生产应用都具有不可替代的功用，尤其为制备丛枝菌根生物学研究所需的大量纯净真菌材料，及生产高纯度菌剂或高效的微生物肥料应用于集约化农业，提供了一条简便易行的途径。
附图的简要说明附
图1为玻璃珠分室培养系统示意图。植物生长室装入砂土和细砂的混合物，区隔室装入河砂，真菌生长室装玻璃珠。根系可穿过尼龙网A在菌根室中生长，而只有菌丝可畅通无阻地穿过尼龙网B进入真菌生长室。经过一定培养时期，自真菌生长室即可观测、收集到真菌组织。
附图2自真菌生长室分离得到的Glomus versiforme孢子和菌丝体。
实施例真菌菌种为Glomus mosseae(Nicol. & Gerd)Gerdmann & Trappe和Glomus versiforme(Karsten)Berch，以含有寄主植物根段、菌根真菌孢子及根外菌丝的真菌菌种的根际土为接种剂。采用玉米(Zeamays，农大108)为宿主植物进行扩繁。播种前用10％H2O2对种子进行表面消毒并于室温下催芽。
低养分含量的砂土(采自北京大兴庞各庄乡，基本理化性状pH(CaCl2)，7.8；有机质含量，0.39％；全氮，0.027％；速效磷(Olsen-P)，3.9mg/kg；速效钾(NH4OAc-K)，60.4mg/kg)、细砂(过1mm筛)、河砂(粒径1～3mm)和玻璃珠(粒径0.8～1.2mm)。所有培养基质在装盆前均经高压蒸汽灭菌处理(120℃，2小时)。
采用有机玻璃板加工成的分室培养系统，尺寸为(10×15×(3+4+5))cm3。区隔室装入850g河砂，真菌生长室装入960g玻璃珠。播种前将菌根接种剂(接种剂量20克)与沙土混匀装入植物生长菌根室，而后自区隔室浇水(100ml)，待水分渗透均匀后播种。每盆播种5粒，出苗后间留4株。
培养进行8周时，在真菌生长室观测到大量Glomus versiforme孢子及菌丝(见附图2)，同时也观察到Glomus mosseae少量孢子果和菌丝体的形成。Glomus versiforme可回收真菌孢子和菌丝体的量可达20mg干物重，Glomus mosseae可达10mg。
权利要求
1.丛枝菌根真菌的培养方法。该方法使用由区隔分室，真菌生长室，植物生长室组成的三分室培养容器；该方法包括将接种剂装入培养容器的植物生长室，而后自区隔室浇水，将宿主植物种子播种，培养，回收真菌孢子和菌丝体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述接种剂为含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝体的菌土。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养容器为采用应硬质塑料板与尼龙网(孔径1毫米和30微米)加工而成的三分室培养容器。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的培养容器还包括为在植物生长室另一侧增加一个区隔室和真菌生长室，或在真菌生长室另一侧增加一个区隔室和植物生长室而构成五室培养系统。
5.根据权利要求1所述的方法，其中区隔分室和真菌生长室分别装有粗河砂和玻璃珠。
6.根据权利要求1所述的方法，其中接种剂与砂土混匀装入培养容器的真菌生长室。
7.根据权利要求1所述的方法，其中培养周期为8周。
8.权利要求1的培养方法中所用的培养容器。
全文摘要
本发明公开了丛枝菌根真菌的培养方法,该方法使用了特定的培养装置及培养介质。该培养装置为由区隔分室,真菌生长室,植物生长室组成的三分室培养容器,区隔分室和真菌生长室分别装有粗河砂和玻璃珠,该方法包括将菌根真菌接种剂与砂土混匀装入培养容器的植物生长室,而后自区隔室浇水,将宿主植物种子播种,培养,回收真菌孢子和菌丝体。
文档编号A01N63/04GK1354252SQ00132468
公开日2002年6月19日 申请日期2000年11月21日 优先权日2000年11月21日
发明者李晓林, 陈保东 申请人:李晓林, 陈保东