专利名称：一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法
技术领域：
本发明涉及一种丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法。
技术背景黄檗丛枝菌根真菌菌群可能由细凹无梗囊霉04. "ra6/c"/"to)、剌无梗囊 霉(丄w/"osa)、聚丛球囊霉(G. aggreg^wm)、悬钩子状球囊霉(G. n^/or附e)、 美丽盾巨孢囊霉(51. ca/os/ ora)、摩西球囊霉(G. mosseae)、幼套球囊霉 (G. Wwm.c^wm)、地表球囊霉(G. vera(/^附e)禾口透光球囊霉((？. d/ap/zam/m)等多种丛枝菌根真菌真菌组成，菌群结构复杂。现有的分析方法存在分析结果波 动大、准确性差的问题。 发明内容本发明的目的是为了解决目前黄檗丛枝菌根真菌菌群结构分析方法分析 结果波动大、准确性差的问题，而提供的一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分 析方法。黄檗丛枝菌根真菌菌群结构按以下步骤进行分析 一、黄檗丛枝菌根和黄 檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA提取；二、 Nested-PCR扩增真菌18S rDNA NS31/Glol区进行三次PCR扩增；三、用步骤二第三次PCR扩增产物进行 变性梯度凝胶电泳采用变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶变性梯度范围30% 60%、 电泳电压130V、电泳时间8h、电泳温度为60。C;四、采用DNA测序技术， 即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构；其中步骤二中第一次PCR扩增的引物为GeoA2 : 5'-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3' 和 Geoll :5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3';第一次PCR扩增体系为20pL由2pL 含Mg2+10xPCR buffer、 1.6pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2pL浓度为1.0拜ol/L 的Geoll、 2jxL浓度为1.0pmol/L GeoA2、 1U的Taq DNA聚合酶、2pL菌群 总DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第一次PCR扩增反应条件94。C预变性 4min， 94。C变性lmin、 54。C退火lmin、 72。C延伸2min， 30个循环，最后72。C延伸7min;步骤二中第二次PCR扩增以稀释100倍的第一次PCR扩增产物作为模板 DNA ， 第 二 次 PCR 扩增引物为 NS31-GC : 5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC-3'和AMI: 5'画GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3';第二 次PCR扩增体系为20pL由2pL含Mg2+10xPCR buffer、 1.6joL浓度为2.5mmol/L 的dNTP、 2jiL浓度为1.0nmol/L的Geoll、 2pL浓度为1.0^mol/L GeoA2、 1U 的Taq DNA聚合酶、2^L模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第二次PCR 扩增反应条件94。C预变性2min， 94。C变性45s、 65。C退火lmin、 72°0延伸 45s， 30个循环，最后72t:延伸7min;步骤二中第三次PCR扩增以稀释100倍的第二次PCR扩增产物作为模板 DNA ， 第三次 PCR 扩增引物为 NS31-GC : 5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC画3'和Glol: 5'-GCCTGCTTTAAACACTCTA画3';第三次 PCR扩增体系为20pL由2|iL含Mg2+10xPCR buffer、 L6^L浓度为2.5mmol/L 的dNTP、 2pL浓度为1.0jimol/L的Geo11、 2pL浓度为1.0pmol/L GeoA2、 1U 的Taq DNA聚合酶、2pL模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第三次PCR 扩增反应条件94。C预变性2min， 94。C变性45s、 55。C退火lmin、 72。C延伸 45s， 30个循环，最后72。C延伸7min;步骤三中的聚丙烯酰胺凝胶按质量百分比基本上由8%的丙烯酰胺制成。本发明方法针对丛枝菌根真菌遗传保守区18SrDNANS31/Glol进行检测 分析，经过三次PCR扩增黄檗丛枝菌根真菌DNA的拷贝数高，可以获得大量 的目标产物丛枝菌根真菌18S rDNA NS31/Glol区片段(丛枝菌根真菌18S rDNANS31/Gk)1区域片段大小为0.23kb，加上本发明设计的40bp的GC夹序 列为0.27kb)便于步骤三进行变性梯度凝胶电泳(DGGE);因此本发明方法 具有准确性高，重复性好，稳定性高的优点。
图1是具体实施方式
一步骤二Nested-PCR扩增产物的凝胶电泳图，图1 中"M"泳道标样为Marker, "1"泳道标样为黄檗丛枝菌根总DNA第一次PCR扩增产物，"2"泳道标样为黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA第一次 PCR扩增产物，"3"泳道标样为黄檗丛枝菌根总DNA第二次PCR扩增产物， "4"泳道标样为黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA第二次PCR扩增产物， "5"泳道标样为黄檗丛枝菌根总DNA第三次PCR扩增产物，"6"泳道标 样为黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA第三次PCR扩增产物；图2是具体实 施方式一步骤三变性梯度凝胶电泳图，图2中"1"泳道为黄檗丛枝菌根真菌 18S rDNA NS31/Glol区变性梯度凝胶电泳结果，图2中"2"泳道为黄檗根 际土壤丛枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol区变性梯度凝胶电泳结果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式黄檗丛枝菌根真菌菌群结构按以下步骤进行 分析 一、黄檗丛枝菌根和黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA提取；二、 Nested-PCR扩增真菌18S rDNA NS31/Glol区进行三次PCR扩增；三、用 步骤二第三次PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳采用变性聚丙烯酰胺凝 胶，凝胶变性梯度范围30% 60%、电泳电压130V、电泳时间8h、电泳温度 为6(TC;四、采用DNA测序技术，即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构；其中步骤二中第 一 次PCR扩增的引物为GeoA2 : 5'-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC画3' 和 Geoll :5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3';第一次PCR扩增体系为20pL由2^L 含Mg2+10xPCR buffer、 1.6pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2jjL浓度为1.0fimol/L 的Geoll、 2pL浓度为1.0pmol/L GeoA2、 1U的Taq DNA聚合酶、2pL菌群 总DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第一次PCR扩增反应条件94t:预变性 4min， 94。C变性lmin、 54。C退火lmin、 72。C延伸2min， 30个循环，最后72 ""C延伸7min;步骤二中第二次PCR扩增以稀释100倍的第一次PCR扩增产物作为模板 DNA , 第 二 次 PCR扩增引物为 NS31-GC : 5'陽CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC-3'和AMI: 5'-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA國3';第二次PCR扩增体系为20^L由2pL含Mg2+10xPCRbuffer、 1.6^L浓度为2.5mmol/L 的dNTP、 2pL浓度为1.0pmol/L的Geo11、 2pL浓度为1.0|imol/L GeoA2、 1U 的T叫DNA聚合酶、2pL模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第二次PCR 扩增反应条件94。C预变性2min， 94。C变性45s、 65。C退火lmin、 72。C延伸 45s， 30个循环，最后72""C延伸7min;步骤二中第三次PCR扩增以稀释100倍的第二次PCR扩增产物作为模板 DNA ， 第三次 PCR 扩增引物为 NS31-GC : 5'画CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC-3'和Glol: 5'-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3';第三次 PCR扩增体系为20jiL由2pL含Mg2+10xPCRbuffer、 L6^iL浓度为2.5mmol/L 的dNTP、 2pL浓度为1.0pmol/L的Geoll、 2pL浓度为1.0pmol/L GeoA2、 1U 的Taq DNA聚合酶、2pL模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第三次PCR 扩增反应条件94"C预变性2min， 94。C变性45s、 55。C退火lmin、 72。C延伸 45s， 30个循环，最后72'C延伸7min;步骤三中的聚丙烯酰胺凝胶按质量百分比基本上由8%的丙烯酰胺制成。本实施方式步骤二第一次PCR扩增后凝胶电泳没有明显的条带出现则不 必对第一次PCR扩增产物进行稀释，第一次PCR扩增产物可直接作为第二次 PCR扩增的模板DNA。经反复实验证明本实施方式方法具有准确性高，重复性好，稳定性高的优点。本实施方式聚丙烯酰胺凝胶主要由丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、催化剂和 水制成。本实施方式步骤二Nested-PCR扩增产物的凝胶电泳结果如图1所示。凝 胶电泳结果说明本实施方式方法可以获得大量的目标产物真菌18S rDNA NS31/Gk)1区片段。本实施方式变性梯度凝胶电泳结果如图2所示。图2中"1"泳道为黄檗 丛枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol区变性梯度凝胶电泳结果，G1 G5为黄檗 丛枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol区变性梯度凝胶电泳条带；图2中"2"泳 道为黄檗根际土壤丛枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol区变性梯度凝胶电泳结果；T1 T16为黄檗根际土壤丛枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol区变性梯度凝 胶电泳条带。说明本实施方式黄檗丛枝菌根中具有5种丛枝菌根真菌，黄檗根 际土壤中具有16种丛枝菌根真菌。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中按 以下步骤提取黄檗丛枝菌根总DNA: a、长度为1 1.5cm的黄檗丛枝菌根用双 蒸馏水清洗3 5次后放入离心管中，再加入40pL的TE缓冲液，并用无菌枪 头将菌根捣碎，然后加入IO^iL质量浓度为20%的化学整合树脂Chelex-100溶 液，之后沸水浴5min、冰浴5min、 15000r/min离心5min，取上清液，即得到 黄檗丛枝菌根总DNA。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中按 修改后的Bead-Beating法提取黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA。其它步骤 及参数与实施方式一相同。〈110〉黑龙江大学〈120〉 一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法〈160〉 5〈210〉 1 〈211〉 22 〈212〉廳 <213〉人工序列〈220〉<223〉黄檗丛枝菌根真菌菌群PCR扩增用引物GeoA2。 <400〉 1ccagtagtca tatgcttgtc tc 22<210> 2 〈211> 23 <212〉 ■ 〈213〉人工序列<220〉〈223〉黄檗丛枝菌根真菌菌群PCR扩增用引物Geoll。 〈400〉 2accttgttac gacttttact tcc 23<210〉 3 〈211〉 60 〈212〉 ■ <213>人工序列<220><223>黄檗丛枝菌根真菌菌群PCR扩增用引物NS31-GC。 〈400〉 3cgcccggggc gcgccccggg cggggcgggg gcacgggggt tggagggcaa gtctggtgcc 60〈210〉 4 〈211〉 20 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉<223〉黄檗丛枝菌根真菌菌群PCR扩增用引物AM1。 〈400〉 4gtttcccgta aggcgccgaa 20〈210> 5 <211> 19 <212〉腿 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉黄檗丛枝菌根真菌菌群PCR扩增用引物Glol。 <400> 5gcctgcttta aacactcta 19
权利要求
1、一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法，其特征在于黄檗丛枝菌根真菌菌群结构按以下步骤进行分析一、黄檗丛枝菌根和黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA提取；二、Nested-PCR扩增真菌18SrDNA NS31/Glo1区进行三次PCR扩增；三、用步骤二第三次PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳采用变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶变性梯度范围30％～60％、电泳电压130V、电泳时间8h、电泳温度为60℃；四、采用DNA测序技术，即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构；其中步骤二中第一次PCR扩增的引物为GeoA25′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11；5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′；第一次PCR扩增体系为20μL由2μL含Mg2+10×PCR buffer、1.6μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2μL浓度为1.0μmol/L的Geo11、2μL浓度为1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL菌群总DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第一次PCR扩增反应条件94℃预变性4min，94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸7min；步骤二中第二次PCR扩增以稀释100倍的第一次PCR扩增产物作为模板DNA ，第二次PCR 扩增引物为NS31-GC5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′和AM15′-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3′；第二次PCR扩增体系为20μL由2μL含Mg2+10×PCR buffer、1.6μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2μL浓度为1.0μmol/L的Geo11、2μL浓度为1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第二次PCR扩增反应条件94℃预变性2min，94℃变性45s、65℃退火1min、72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸7min；步骤二中第三次PCR扩增以稀释100倍的第二次PCR扩增产物作为模板DNA，第三次PCR扩增引物为NS31-GC5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′和Glol5′-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3′；第三次PCR扩增体系为20μL由2μL含Mg2+10×PCR buffer、1.6μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2μL浓度为1.0μmol/L的Geo11、2μL浓度为1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第三次PCR扩增反应条件94℃预变性2min，94℃变性45s、55℃退火1min、72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸7min；步骤三中的聚丙烯酰胺凝胶按质量百分比基本上由8％的丙烯酰胺制成。
2、 根据权利要求1所述的一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法， 其特征在于步骤一中按以下步骤提取黄檗丛枝菌根总DNA:a、长度为l~1.5cm 的黄檗丛枝菌根用双蒸馏水清洗3~5次后放入离心管中，再加入40nL的TE 缓冲液，并用无菌枪头将菌根捣碎，然后加入10^iL质量浓度为20c/。的化学整 合树脂Chelex-lOO溶液，之后沸水浴5min、冰浴5min、 15000r/min离心5min， 取上清液，即得到黄檗丛枝菌根总DNA。
3、 根据权利要求1所述的一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法， 其特征在于步骤一中按修改后的Bead-Beating法提取黄檗根际土壤丛枝菌根 真菌总DNA。
全文摘要
一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法，它涉及一种真菌菌群结构的分析方法。它解决了目前黄檗丛枝菌根真菌菌群结构分析方法分析结果波动大、准确性差的问题。分析步骤一、提取DNA；二、Nested-PCR；三、变性梯度凝胶电泳；四、采用DNA测序技术，即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构。本发明方法针丛枝菌根真菌遗传保守区18S rDNA NS31/Glo1进行检测分析，经过三次PCR扩增黄檗丛枝菌根真菌DNA的拷贝数高，可以获得大量的目标产物丛枝菌真菌18S rDNA NS31/Glo1区片段，便于步骤三进行变性梯度凝胶电泳；因此本发明方法具有准确性高，重复性好，稳定性高的优点。
文档编号C12Q1/68GK101333566SQ20081013684
公开日2008年12月31日 申请日期2008年7月30日 优先权日2008年7月30日
发明者接伟光, 雪 王, 葛菁萍, 蔡柏岩, 阎秀峰 申请人:黑龙江大学