专利名称：丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法
技术领域：
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种丛枝菌根真菌孢子的高密 度纯种生产方法。
背景技术：
丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizae， AM)是自然界中普遍存在的，与80% 以上陆地植物共生的真菌。在自然界中，AM真菌的寄主和分布范围均很广泛， 能与绝大多数植物形成共生关系，至今已发现150多种AM真菌能与植物形成共 生体，是菌根中最普遍的类型之一。它与宿主植物互惠共生真菌的根外菌丝 从土壤中吸收磷素及其它营养元素供给宿主植物，改善了植物对矿质元素的吸 收能力，促进植物生长等，宿主植物则供给真菌生长所必需的碳水化合物。由 于AM真菌在植物生存中的重要地位，同时作为一种生物技术措施，其在农林业、 绿化和环境保护等方面的应用前景是十分广阔的，世界各国对它的应用均寄予 了很高的期望。因此，丛枝菌根逐步发展成为了一个十分活跃的研究领域，国 内外学者对其资源、分类、生理生态及其应用等方面进行了广泛的探索与研究。
目前美洲、欧洲、亚洲、太平洋等发达国家和发展中国家都在加紧研究AM 菌根真菌在农林业、绿化和环境保护等领域中的应用途径和方法，近年来已取 得了较快的进展。由于AM真菌是专性共生真菌，自身不能合成DNA，到目前为 止，该真菌的纯培养尚未取得成功，所以不能像外生菌根真菌那样通过工业发 酵大规模地生产接种菌剂。只能将其接种在植物根系上，经过2—4个月的共生 培养，与宿主植物一起生长发育，才能得到其繁殖体。AM菌剂生产的方法，概括起来有以下几种:盆栽培养法、静止培养法、流动液培养法、喷雾培养法、大 田培养法等，其中盆栽培养法在目前仍是一种最传统经济的方法。目前已有一 些国家真菌制剂的生产应用已经商品化，如美国、英国、法国、日本等国均有 AM菌剂出售，他们的制剂纯度高，质量好，大都通过严格控制各种环境因子进 行温室工厂化生产；如英国洛桑农业研究中心生产出名为AM菌剂已经在英国、 法国、丹麦、荷兰和日本等国家广泛地运用于蔬菜、花卉、果树等；同时在新 西兰和澳大利亚的牧草生产上均获得了显著的经济效益和生态效益。但中国目 前还没有工厂化商业菌剂生产，因此AM真菌菌根的高效培养技术对我国的农林 业、环境保护等都具有深远的意义。
丛枝菌根真菌常规培养方法主要是采用土攘或者河砂为基质，单一作物(如 玉米、三叶草)为寄主植物。菌根真菌的培养效率可以通过调节培养基质的组 成和培养条件得到提高，Atimanav等比较了不同粒径的膨胀矿物材料对丛枝菌 根真菌生产的影响(At imanav Gaur， A. dholeya. Effects of the particle size of soil-less substrates upon AM fungus inoculum production 2000， 10: 43—48);英国PLANT W0RK公司(www. Plantworksuk.uk )采用一种膨胀矿物 作为基质培养丛枝菌根真菌，同时在培养过程中使用了缓释性磷肥控制和调节 植物与菌根真菌的生长。这些方法大多采用单一膨胀矿物或膨胀矿物加草碳的 方式，培养效率不够高。文献(Sylvia, D. M. and D. H. Hubbell. 1986. Growth and sporula/tion of vesicular-arbusculeir mycorrhizal fungi in aeroponic and membrane systems. Symbiosis 1: 259-267)采用气雾法培养菌剂，在密 闭的容器中用雾化装装置将营养液变成气雾喷在侵染有菌根真菌的植物根系 上，获得纯净的菌荆。这个方法的优点是可以获得十分纯净的菌剂，但是成本 高、产量低。丛枝菌根真菌菌剂商业化生产都是采用在温室条件下将寄主植物与丛枝菌
根真菌共同培养4-5个月的方式进行，由于丛枝菌根真菌不能离开宿主植物单独 培养，因此该菌剂大规模生产十分困难，且寄主植物的类型、培养基质的配方、 培养条件均为生产工艺的关键。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种能够大规模生产，成 本低，产量高的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法的技术方案。
所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于包括以下工
艺步骤
1) 将毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根的根组织培养在改进合成培养基 中，在黑暗中，温度23-25"C条件下，培养5 — 7个星期；
2) 将上述培养的毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根的根组织转接至新的 改进合成培养基中，再在培养基中接种丛枝菌根真菌，丛枝菌根真菌接种孢子 量为300-500个/mL，在黑暗中，温度23-25。C条件下，培养7-IO个星期；
3) 在步骤2)的培养基中取含有被丛枝菌根真菌侵染的根、菌丝和孢子的 直径为1.5-2.5cm的培养物移种至专用培养盒中含有改进合成培养基的一室， 并把新鲜培养的毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根的根组织移种至培养物旁， 所述的专用培养盒为两室培养盒，两室之间设置350-450目的横隔网，专用培 养盒另一室中含有丛枝菌根真菌RT培养基，将上述的培养物在黑暗中，温度 23-25t:条件下，培养7-IO个星期；
4) 取上述专用培养盒含有丛枝菌根真菌RT培养基一室中的孢子和菌丝体， 溶解于8-ll毫摩尔无菌柠檬酸钠溶液中，并调pH至5. 5-6. 5，充分搅拌，再倾 倒于无菌的0. 45um孔径的筛子，用无菌水洗涤至只剩孢子和菌丝体；5)取上述得到的孢子和菌丝体，用筛子收集孢子，清洗干净后，浸泡于含 有链霉素100-300 mg/L和庆大霉素50-200mg/L的20°/。的甘油无菌溶液中保存。
所述的丛枝菌根真菌孢'子的高密度纯种生产方法，其特征在于所述的改进 合成培养基含有硫酸镁720-740mg/L、硝酸钾70-90 mg/L、氯化钾55-75 mg/L、 硝酸钙270-290mg/L、 EDTA铁钠盐5-12mg/L、肌醇40-60 mg/L、硫酸锰 0. 01-0. 08 mg/L、硫酸铜0. 01-0. 03 mg/L、硼酸0. 3-0. 6 mg/L、硫酸锌0. 1-0. 4 mg/L、碘化钾0. 01-0. 03mg/L、钼酸钠0. 01-0. 03 mg/L、氯化钴0. 01-0. 04 mg/L、 维生素BO. 1-0. 3mg/L 、卩必哆醇0. 1-0. 3mg/L、烟酸0.2-0.8 mg/L、蔗糖 7500-8500mg/L、葡萄糖4500-5500mg/L和植物胶3500-4500mg/L。
所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于所述的改进 合成培养基含有硫酸镁725-735mg/L、硝酸钾75-85 mg/L、氯化钾60-70 mg/L、 硝酸韩275-285mg/L、 EDTA铁钠盐7-9mg/L 、肌醇45-55mg/L 、硫酸锰 0. 01-0. 05mg/L、硫酸铜0. 01-0. 02mg/L、硼酸0. 4-0. 5mg/L、硫酸锌0. 2-0. 3 mg/L、碘化钾0. 01-0. 02mg/L、钼酸钠0. 01-0. 02 mg/L、氯化钴0. 02-0. 03 mg/L、 维生素BO. l-0.2mg/L、卩必哆醇0. l-0.2mg/L、烟酸0.4-0.6 mg/L 、蔗糖 7800-8200mg/L、葡萄糖4800-5200mg/L和植物胶3700-4200mg/L。
所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于步骤2)中丛 枝菌根真菌为丛枝菌根真菌的球囊霉属，丛枝菌根真菌接种孢子的量为350-450 个/mL，培养温度为23.5-24.5'C条件下，培养8-9个星期。
所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于步骤2)中丛 枝菌根真菌为根内球囊霉。
所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于步骤3)中专 用培养盒中间设置的横隔网为370-400目，培养条件为在黑暗中，温度23.5-24.5X:条件下，培养8-9个星期。
所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于步骤3)中丛 枝菌根真菌RT培养基为在改进合成培养基中减少蔗糖和葡萄糖两个组分，并加 入培养基重量0. 1-0. 2%的酒石酸氨和培养基体积2-5%的根浸出液。
所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于步骤4)专用 培养盒含有丛枝菌根真菌培养基一室中的孢子和菌丝体，溶解于9-10毫摩尔无 菌柠檬酸钠溶液中，并调pH至5.8-6.2。
所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于步骤5)中 20%的甘油无菌溶液中含有链霉素150-250 mg/L和庆大霉素100-150mg/L。
所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于根浸出液为 培养毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根组织得到的液体。
本发明通过配置改进合成培养基及采用专用的培养盒进行丛枝菌根真菌的 培养，与现有技术相比较，本发明的优点在于l培养基是无菌环境的，成本低 廉，既满足寄主植物生长又适合AM真菌生长；2寄主植物生长营养要求低，可 以在合成培养基上生长培养；3由该方法培养的孢子(含有菌丝体)是无污染纯 种培养物；4生产的孢子保存于液体中，可以保持90%活性以上。本技术生产出 的孢子可以用于菌根菌剂的繁殖，生物肥料的生产，以及科研上提供无污染的 纯种孢子，用于基础研究。
具体实施例方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明。丛枝菌根真菌在市场上均有售， 毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根的技术均为现有技术。 实施例 l.培养基配制用于培养毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根和丛枝菌根真菌的培养基组 成(组分浓度为mg/L，用超净水配制)
硫酸镁731硝酸钾80
氯化钾65硝酸钙288
EDTA铁钠盐8肌醇50
硫酸锰0. 04硫酸铜0. 025
硼酸0. 45硫酸锌0. 22
碘化钾0. 01钼酸钠0. 02
氯化钴0. 025维生素B0. 1
秘口多醇0. 1烟酸0. 5
蔗糖■0葡萄糖5000
其中Mn和Zn控制在非常低的浓度。这两种元素能抑制孢子的萌发。培养 基加4000mg/L植物胶(约占培养基重量的0.4%)凝固，因为植物胶中含有高磷 浓度，所以在培养基中省去KH2P04。培养基在l公斤压力，12rC灭菌20min。丛 枝菌根真菌RT培养基配制就是在改进合成培养基中减少蔗糖和葡萄糖这两个组 分并加入酒石酸氨和根浸出液。
2. 根组织培养
将毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根培养在如上培养基中，在黑暗中，温 度24'C下，培养5个星期，培养至根组织长满整个培养皿(15cm直径)，再将根 组织转接至新的改进合成培养基中，同时在培养基中接种根内球囊霉，接种量 为400个/ml，在黑暗中，温度24。C下，培养8个星期。
3. 移种和孢子繁殖
取上述的培养基中含有被丛枝菌根真菌侵染的根、菌丝和孢子的一小块的培养物移接至两室不锈钢培养盒的其中一室，这一室中含有改进合成培养基，
同时把鲜新培养的根组织移种至该小块接种物旁边；而培养皿的另外一室含有 丛枝菌根真菌RT培养基，丛枝菌根真菌RT培养基含有培养基重量O. 1%或0.2%的 酒石酸氨和培养基体积2%、 3%或5%的根浸出液(含倍半萜素)，并且中间横隔 网400目不让根生长至这一室。于是在黑暗中，温度24'C下培养8个星期后，真 菌菌丝就爬过中间横隔在另一室繁衍生长。
4. 孢子收获
在含有丛枝菌根真菌RT培养基的另一室培养基培养成熟后的孢子连同培养 基一起溶解于10mM无菌柠檬酸钠溶液中，并调pH至6.0，在磁力搅拌器中充分搅 拌使固体胶溶解，再倾倒于无菌的0.45um孔径的筛子上，用无菌水洗涤至只有 孢子和菌丝体。
5. 孢子保存
用筛子收集孢子，清洗干净后，就可以浸泡于含有20%甘油、链霉素 (200mg/L)、庆大霉素(100mg/L)的无菌溶液中，在4。C下可以保存1年以上。
孢子数量检测可以采用体视显微镜放大20倍观察计数。产品可以分为孢子 数量为1000个/ml， 5000个/ml和10000个/ml三个不同规格，本发明以前的技术的 得到的孢子数100-120个/ml，而本发明技术得到的孢子数一般在1500-2000个 /ml。
步骤l中培养基的含量为(单位为mg/L):
硫酸镁720、硝酸钾70、氯化钾55、硝酸钙270、 EDTA铁钠盐5、肌醇 40、硫酸锰O.Ol、硫酸铜O.Ol、硼酸0.3、硫酸锌O. 1、碘化钾0.01、钼酸钠 0.01、氯化钴O.Ol、维生素BO. 1、卩必哆醇O. 1、烟酸0.2、蔗糖7500、葡萄糖 4500和植物胶3500或采用硫酸镁740、硝酸钾90、氯化钾75、硝酸钙290、 EDTA铁钠盐12、肌 醇60、硫酸锰0.08、硫酸铜0.(J3、硼酸0.6、硫酸锌0.4、碘化钾0.03、钼酸钠 0.03、氯化钴0.04、维生素B0.3、秘、哆醇0.3、烟酸0.8、蔗糖8500和葡萄糖 5500;
或采用硫酸镁725、硝酸钾85、氯化钾60、硝酸钙275、 EDTA铁钠盐7、肌醇 45、硫酸锰O.Ol、硫酸铜O.Ol、硼酸0.4、硫酸锌0.2、碘化钾0.015、钼酸钠 0.02、氯化钴0.02、维生素B0.2、卩必哆醇0.2、烟酸0.6、蔗糖8200和葡萄糖 5200植物胶4500。
步骤2的丛枝菌根真菌换成丛枝菌根真菌的球囊霉属得其他真菌，培养条 件采用在黑暗中，温度23、 23.5、 24、 24. 5或25。C下培养7、 8、 9、或10个 星期，孢子接种量为300个/ml、 350个/ml、 400个/ml或450个/ml，步骤3中 培养条件采用在黑暗中，温度23、 23.5、 24、 24. 5或25'C下培养50、 55或60 天，专用培养盒横隔网采用350或370目；步骤4中采用8mM、 9mM或llmM的 无菌拧檬酸钠溶液中，并调pH至5. 5、6. 0或6. 5;步骤5中加入链霉素100mg/L、 庆大霉素50mg/L，或链霉素300mg/L、庆大霉素200mg/L，或链霉素150mg/L、 庆大霉素150mg/L，其他步骤和条件均与实施例相同，最后也能达到与实施例相 同的技术效果。
1权利要求
1.丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于包括以下工艺步骤1)将毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根的根组织培养在改进合成培养基中，在黑暗中，温度23-25℃条件下，培养5-7个星期；2)将上述培养的毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根的根组织转接至新的改进合成培养基中，再在培养基中接种丛枝菌根真菌，丛枝菌根真菌接种孢子量为300-500个/mL，在黑暗中，温度23-25℃条件下，培养7-10个星期；3)在步骤2)的培养基中取含有被丛枝菌根真菌侵染的根、菌丝和孢子的直径为1.5-2.5cm的培养物移种至专用培养盒中含有改进合成培养基的一室，并把新鲜培养的毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根的根组织移种至培养物旁，所述的专用培养盒为两室培养盒，两室之间设置350-450目的横隔网，专用培养盒另一室中含有丛枝菌根真菌RT培养基，将上述的培养物在黑暗中，温度23-25℃条件下，培养7-10个星期；4)取上述专用培养盒含有丛枝菌根真菌RT培养基一室中的孢子和菌丝体，溶解于8-11毫摩尔无菌柠檬酸钠溶液中，并调pH至5.5-6.5，充分搅拌，再倾倒于无菌的0.45um孔径的筛子，用无菌水洗涤至只剩孢子和菌丝体；5)取上述得到的孢子和菌丝体，用筛子收集孢子，清洗干净后，浸泡于含有链霉素100-300mg/L和庆大霉素50-200mg/L的20％的甘油无菌溶液中保存。
2. 如权利要求1所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征 在于所述的改进合成培养基含有硫酸镁720-740mg/L、硝酸钾70-90 mg/L、 氯化钾55-75 mg/L、硝酸鈣270-290mg/L、 EDTA铁钠盐5-12mg/L、肌醇40-60 mg/L、硫酸锰0.01-0.08 mg/L、硫酸铜0.01-0.03 mg/L、硼酸0. 3-0. 6 mg/L、硫酸锌0. 1-0. 4 mg/L、碘化钾0. 01-0. 03mg/L、钼酸钠0. 01-0. 03 mg/L、氯化 钴0. 01-0. 04 mg/L、维生素B0. 1-0. 3mg/L、秘哆醇0. 1-0. 3mg/L、烟酸0. 2-0. 8 mg/L、蔗糖7500-8500mg/L、葡萄糖4500-5500mg/L和植物胶3500-4500mg/L。
3. 如权利要求1所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征 在于所述的改进合成培养基含有硫酸镁725-735mg/L、硝酸钾75-85 mg/U 氯化钾60-70 mg/L、硝酸转275-285mg/L、EDTA铁钠盐7-9mg/L、肌醇45-55mg/L、 硫酸锰0. 01-0. 05mg/L、硫酸铜0.01-0.02mg/L、硼酸0. 4-0. 5mg/L、硫酸锌 0. 2-0. 3 mg/L、碘化钾0. 01-0. 02mg/L、钼酸钠0. 01-0. 02 mg/L、氯化钴0. 02-0. 03 mg/L、维生素BO, 1-0. 2mg/L、卩必哆醇0. 1-0. 2mg/L、烟酸0. 4-0. 6 mg/L、蔗糖 7800-8200mg/L、葡萄糖4800-5200mg/L和植物胶3700-4200mg/L。
4. 如权利要求1所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征 在于步骤2)中丛枝菌根真菌为丛枝菌根真菌的球囊霉属，丛枝菌根真菌接种孢 子的量为350-450个/mL，培养温度为23. 5-24. 5"C条件下，培养8-9个星期。
5. 如权利要求1所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征 在于步骤2)中丛枝菌根真菌为根内球囊霉。
6. 如权利要求1所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征 在于步骤3)中专用培养盒中间设置的横隔网为370-400目，培养条件为在黑 暗中，温度23.5-24.5'C条件下，培养8-9个星期。
7. 如权利要求1所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征 在于步骤3)中丛枝菌根真菌RT培养基为在改进合成培养基中减少蔗糖和葡萄 糖两个组分，并加入培养基重量0.1-0. 2%的酒石酸氨和培养基体积2-5%的根浸 出液。
8. 如权利要求1所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征在于步骤4)专用培养盒含有丛枝菌根真菌培养基一室中的孢子和菌丝体，溶解 于9-10毫摩尔无菌拧檬酸钠溶液中，并调pH至5. 8-6. 2。
9. 如权利要求1所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征 在于步骤5)中20%的甘油无菌溶液中含有链霉素150-250 mg/L和庆大霉素 100-150mg/L。
10. 如权利要求7所述的丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，其特征 在于根浸出液为培养毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根组织得到的液体。
全文摘要
丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法，属于微生物培养技术领域。包括以下工艺步骤1)培养毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根组织；2)毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根组织与丛枝菌根真菌一起培养在改进合成培养基；3)在上述培养基中取含有被丛枝菌根真菌侵染的根、菌丝和孢子的直径为培养物移种至专用培养盒中进行培养；4)收集孢子和菌丝体；5)保存丛枝菌根真菌孢子。本发明与现有技术相比较，优点在于1培养基是无菌环境的，成本低廉，既满足寄主植物生长又适合AM真菌生长；2寄主植物生长营养要求低，可以在合成培养基上生长培养；3由该方法培养的孢子是无污染纯种培养物；4生产的孢子保存于液体中，可以保持90％活性以上。
文档编号C12N3/00GK101565689SQ20091009898
公开日2009年10月28日 申请日期2009年5月26日 优先权日2009年5月26日
发明者金海如 申请人:浙江师范大学