专利名称：粘着箭菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及固氮菌和植物根际促生细菌粘着箭菌Ensifer adhaerens CGMCC 6315在盐胁迫条件下提高黄豆发芽率的应用。
背景技术：
植物根际促生菌PGPR是ー类具有促进作物活力并增加产量，抑制植物病原菌、根际有害微生物的根际微生物。PGPR是生物肥料和生物农药的重要资源库，其筛选、开发和应用受到越来越多的重视。PGPR促进植物活力的机制可分为直接和间接促进作用两种方式。直接促进作用包括产生植物生长激素、固氮作用、加 强对营养物质的吸收利用(主要是铁离子的利用和固态磷的溶解)等；间接促进作用方式主要是PGPR能抑制植物病原菌的生长及改善病原菌对植物的侵染条件，从而促进植物的生长。在直接促进作用方式中，PGPR可提供外源激素而影响作物的生长，ー些PGPR能产生IAA，改善受盐胁迫的植物自身合成生长素IAA的能力受到抑制的不利影响。PGPR还可通过产生嗜铁素向植物提供铁-嗜铁素复合体，从而增加植物对铁营养的吸收。土壤盐溃化对农业的影响是ー个全球性的问题，全球20%的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁，我国的盐溃地总面积约I亿公顷。当盐浓度达一定值时会破坏植物细胞的正常生命活动，使植株的生长受到抑制，因而土壤盐溃化造成土地产出率低，农业综合生产能力严重不足，制约了农业生产的发展。申请人:筛选到ー株命名为TMX-23的菌株，该菌株具有固氮能力，基因组中有两种不同的固氮酶还原酶基因(nifH)。该菌株产生吲哚こ酸、胞外多糖、嗜铁素、水杨酸、2，3- ニ羟基苯甲酸、氰化氢和氨。TMX-23菌株被鉴定为粘着箭菌万.adhaerens, TMX-23菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为=CGMCC 6315。目前尚未见有万.aofeereas作为植物根际促生菌的研究报道。万.adhaerens CGMCC 6315菌株可用作PGPR菌剂，显著提高盐胁迫下的黄豆发芽率。该菌株可应用于盐溃地的农业生产，提高作物的活力和产量。
发明内容
本发明的目的是提供ー种具有固氮能力和具有PGPR活性的菌株，及其应用于盐胁迫条件下的黄豆发芽率的提高。本发明所提供的菌株为ー种粘着箭菌^'. at/Aaere/751,该菌株现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC 6315。其形态结构如图I所示。该菌株的基于16S rDNA序列分析的系统发育树如图2所不。本发明提供的^: adhaerens CGMCC 6315菌株具有固氮能力。如图3所示，该菌株可在固氮培养基上生长。从其基因组DNA中克隆获得两个固氮酶还原酶基因nifH(图4泳道I中的条带3和4)片段。DNA序列遗传进化树分析(图5)显示这两个nifH基因片段分别与及 sp. TJ170和蓝细菌sp. MCC-3A的nifH基因的同源性为100%。
本发明提供了万.adhaerens CGMCC 6315菌株具有PGPR活性，可产生PGPR物质如吲哚こ酸、嗜铁素、水杨酸、2、3_ ニ羟基苯甲酸、胞外多糖、氰化氢和氨等。上述所述的应用是将疋adhaerens CGMCC 6315接种至黄豆(67ァmax L.)上，在培养箱中进行发芽。在含有50-154mmol/L的氯化钠溶液的胁迫条件下，接种了万.adhaerens CGMCC 6315菌株的黄豆比未接种菌株的对照组具有更高的发芽率。
图I E. adhaerens CGMCC 6315的扫 描电镜照片。图2 万.aofeaereas CGMCC 6315 的 16S rDNA 序列系统发育树。图3万.aofeaereas CGMCC 6315在固氮培养基上生长的菌落图。图4从万.adhaerens CGMCC 6315基因组中克隆nifH基因的琼脂糖凝胶电泳图。图5疋adhaerens CGMCC 6315的nifH基因序列系统发育树。
具体实施例方式实例ー植物根际土壤固氮菌株的分离筛选、鉴定和生物学特性 I.菌株分离
从江苏省南京市地区采集土壌，取2g 土壤加入含10颗玻璃珠的18mL无菌水中，振荡5min，静置IOmin后，取IOml悬液加入250ml含1%葡萄糖的矿物盐培养基中。矿物盐培养基的组成为I. 36 g/L KH2PO4, 2. 13g/L Na2HPO4,0. 5 g/L MgSO4 7H20 和 lOmL/L 金属离子液，pH 7.5。金属离子液组成为0.40 g/L CaCl2 2H20, 0. 30 g/L H3BO3, 0. 04 g/L CuSO4 5H20, 0. 10 g/L KI, 0. 20 g/L FeSO4 7H20，0. 40 g/L MnSO4 7H20，0. 20 g/LNaMoO4 *2H20和10. 0 mL/L浓盐酸。样品于30°C、转速为220rpm的摇床中培养I个月。取IOml悬液接种到上述新鮮的含1%葡萄糖的矿物盐培养基中，并在上述培养条件下培养I个月，重复上述步骤一次。取100耵样品稀释到10_2-10_4后，涂布于LB固体培养基上。LB培养基组成为蛋白胨10g/L ;酵母膏5g/L ；NaCl 10g/L ；pH7. 2。从LB平板挑取形态不同的单菌落划线至LB平板上，30°C培养1-2天后，再次进行菌种平板划线纯化。获得3株形态不同的细菌。固氮菌的筛选
将上述3种细菌接种到LB平板上，待其长出单菌落后，挑单菌落划线到Nfb固体培养基上，30°C培养。Nfb 培养基组成为KH2PO4 1.2 g/L、K2PO4 0.8 g/L、Glucose 5 g/L、MgSO4- 7H20 0.2 g/L、NaCl 0.2 g/L、CaCl. 2H20 0. 02 g/L、FeSO4 7H20 0.002 g/L、金属离子液 2mL。金属离子液组成为NaMo04 2H20 1.0 g/L、MnSO4 H2O I. 75 g/L、H3BO3 I. 4 g/L、CuSO4-5H20 0. 04 g/L、ZnSO4 7H20 0. 12 g/L。培养一周后，其中命名为 TMX-23 的菌株在固氮培养基上出现非常明显的菌落生长。菌株的鉴定及生物学特性
在LB固体培养基上，TMX-23菌落呈乳白色、不透明、光滑、有粘液、凸起、边缘规整。革兰氏阴性。如图I所示，TMX-23菌体呈杆状，大小为0.4-0.6X1.0-1.5iim。无鞭毛，无芽胞。采用16S rDNA序列分析进行TMX-23菌株的分子鉴定。从含LB固体培养基上用无菌牙签挑取适量的TMX-23菌体到20iU无菌水的离心管中，混匀，100°C加热处理lOmin，瞬时离心，待菌体冷却，每50 ill PCR体系加入5 作为模板。采用细菌16S rDNA基因扩增通用正向引物Kl和K2进行16S rDNA片段的PCR扩增，引物Kl的序列为5’- AACTGAAGAGTTTGATCC TGGCTC-3，(SEQ ID No : I )，引物 K2 的序列为5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’ (SEQ ID No :2)。PCR 扩增条件为94°C预变性 2min 后，94°C变性lmin，59°C退火I. 5min，72°C延伸2min，共30个循环，72°C延伸IOmin0所得序列由生エ生物工程(上海)有限公司测序后，得到的部分16S rDNA序列(SEQ ID No :3)在美国国家生物技术信息中心的GenBank数据库中进行blast搜索并构建系统发育树。如图2所示，TMX-23菌株与及 adhaerens处于同一个分支，相似性达到99%。因而TMX-23菌株被鉴定为万.adhaerens。TMX-23菌株于年2012年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北 京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院研究所；保藏编号为CGMCC No. 6315,分类命名为粘着箭菌如パ/ぽadhaerens。固氮酶还原酶基因克隆
E. adhaerens CGMCC 6315在固氮培养基上出现非常明显的菌落生长(图3)，因而进ー步克隆其固氮酶还原酶基因进行验证。用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp BacteriaDNA Kit)提取ムadhaerens CGMCC 6315基因组DNA。采用巢式PCR克隆nifH基因。使用两对简并引物进行两轮PCR反应，弓I物序列分别为N-F-A (5，-GCNWTNTAYGGNAARGGNGG-3，)(W表示碱基为A/T，Y表示碱基为C/T，N表示碱基为A/T/C/G或其它，R表示碱基为A/G, V 表示碱基为 A/C/G，B 表示碱基为 C/G/T) (SEQ ID No :4)、N-F-B (5，-GGNTGTGAYCCNAAVGCNGA-3，)(SEQ ID No 5)和 N-R (5，-GCRTANABNGCCATCATYTC-3，)(SEQ IDNo :6)。以基因组DNA为模板，以引物N-F-A和N-R为模板进行第一轮PCR扩增。反应体系(25W)为10 X PCR 缓冲液 2. 5W，dNTP 2^1, MgCl2 2W，引物 N-F-A 0. m,引物 N-R0. 5W，模板(基因组)ll^l，Ex-taq DNA聚合酶0. 5耵，加水至25耵。PCR反应条件95°C预变性5min，95°C变性50 S，55°C退火50 s，72°C延伸Imin，反应29个循环，最后72°C保温IOmin0用DNA纯化试剂盒对将上述PCR产物进行纯化。以上述PCR纯化产物为模板，以N-F-B和N-R为引物进行第二轮PCR。反应体系和扩增条件同第一轮PCR。第二轮PCR扩增结果如图4所示。对PCR产物条带进行切胶回收和纯化。纯化产物采用pMD18-T载体试剂盒(TaKaRa公司)进行TA克隆后，送生エ生物工程(上海)有限公司测序。测序结果显示图4中的条带I和2为非特异性扩增，条带3 (SEQ ID No 7)和条带4 (SEQ ID No 8)测得的序列均为368bp。在genbank数据库中Blast分析显示,条带3和条带4均为nifH基因，系统发育树分析(图5)显示条带3测得的DNA序列与如Wffer sp. TJ170的nifH基因同源性为100% ;条带4测得的序列与蓝细菌むsp. MCC-3A的nifH基因的同源性为100%。上述结果表明万.adhaerens CGMCC 6315有两种不同的固氮酶还原酶基因。实例ニ^: adhaerens CGMCC 6315 菌株的 PGPR 活性测定
参照Bric等1991年报道的方法测定口引哚こ酸IAA的含量；參照Alexander和Zubererl991年报道的方法在铬天青固体平板上测定铁载体siderophore的分泌；參照Reeves等1983年报道的方法测定水杨酸SA和2，3_ ニ羟基苯甲酸DHBA的含量；胞外多糖EPS含量测定參照Mody等1989年报道的方法；磷的释放、氰化氢和氨的释放按照Schippers等1990年报道的方法进行检测。测定结果表明万.adhaerens CGMCC 6315菌株培养24h后产生8. 2Mg/mL卩引哚こ酸、5. 7 mg/mL胞外多糖、培养48h后产生6. 9 Mg/mL水杨酸和0. 48 Mg/mL2, 3-ニ轻基苯甲酸;万.adhaerens CGMCC 6315分泌嗜铁素,氰化氢和氨，但不具有溶磷作用。上述结果表明万.adhaerens CGMCC 6315是ー种植物根际促生细菌。实例三在盐胁迫条件下，在黄豆表面接种疋adhaerens CGMCC 6315可促进其发芽
挑取大小一致的黄豆若干颗，自来水浸泡6 h。用70%こ醇消毒30S，用无菌水冲洗去除こ醇。瓦adhaerens CGMCC 6315菌体在LB液体培养基中培养16h，离心、无菌水洗涤后，用不同浓度的氯化钠溶液悬浮，菌体浓度调节为IO8菌落形成単位(CFU)。将经上述处理过的黄豆分别放入含有菌株的不同浓度的NaCl溶液中浸泡30min。在9cm无菌培养皿底放入ー层灭菌滤纸，加 入4mL上述不同浓度的NaCl溶液。每个培养皿放入20颗上述经处理的黄豆，培养皿放入培养箱中，28°C培养。实验设置三个平行，重复三次。4d后计算发芽率。在50mmol/L的NaCl浓度下，接种了万.adhaerens CGMCC6315的黄豆的发芽率由对照组的58. 9%提高到67. 2%。实例四与实例三相同，NaCl浓度提高至100mmol/L。接种了万.adhaerens CGMCC6315的黄豆的发芽率由对照组的52. 8%提高到63. 9%。实例五与实例三相同,在154mmol/L NaCl浓度下,接种了允adhaerens CGMCC6315的黄豆的发芽率由未接种菌株的42. 8%提高到55. 6%。本发明并不仅仅限于上述的实施例。
权利要求
1.一种粘着箭菌StZAaerefl1S),它的保藏编号为CGMCC 6315。
2.根据权利要求I所述粘着箭菌adhaerens)CGMCC6315,其特征在于,该菌株为固氮菌，其基因组上具有如SEQ ID No 7和SEQ ID No 8所示的固氮酶还原酶基因片段序列。
3.粘着箭菌(Aasi/eradhaerens) CGMCC 6315在提高黄豆发芽率中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用方法,其特征在于,是将粘着箭菌adhaerens)CGMCC 6315接种至黄豆上，在含有50mmol/L至154mmol/L浓度的氯化钠的盐溶液中进行培养发芽。
全文摘要
本发明公开了粘着箭菌Ensiferadhaerens CGMCC 6315是一种具有固氮能力的细菌；该菌株也是一种植物根际促生细菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR)，可产生吲哚乙酸(IAA)、胞外多糖(EPS)、嗜铁素(siderophore)、水杨酸(SA)、2，3-二羟基苯甲酸(DHBA)、氰化氢(HCN)和氨。在含有氯化钠的盐胁迫条件下，接种了E.adhaerens CGMCC 6315的黄豆可比未接种菌株的对照组具有更高的发芽率。
文档编号A23L1/202GK102851237SQ201210277930
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者戴亦军, 王颖, 翟闪, 周广灿, 葛峰, 袁生 申请人:南京师范大学