专利名称：：一株修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物，特别是一株丛枝菌根真菌。技术背景阿特拉津(2-氯-4-乙氨基-6-异丙氨基-l)主要作为农用除草剂使用，由于长期使用导致在土壤中大量残留，农作物大幅减产。阿特拉津污染土壤的修复可采用物理、化学和生物方法，由于物理处理方法只是将污染物转移，不能彻底消除阿特拉津，且成本昂贵；而化学处理方法则易造成其它环境介质的次生污染；所以目前主要采用生物方法处理阿特拉津。生物修复阿特拉津污染土壤分为两类第一类方法是选用具有阿特拉津降解能力的微生物菌株修复阿特拉津污染土壤，但是由于目前微生物修复菌株在土壤中竞争不过土著微生物种群，所以易导致其代谢活性丧失，而且当土壤中的阿特拉津浓度过低无法满足微生物对降解底物需求时，就无法正常发挥其降解功能。第二类方法是选用植物修复阿特拉津污染土壤，但存在可忍耐和超量积累阿特拉津的植物种类少，且植物的生物量小、生长缓慢、生长周期长的问题。因此，目前采用生物修复阿特拉津污染土壤的效果不理想。
发明内容本发明要解决目前采用生物修复阿特拉津污染土壤效果不理想的问题，而提供的一株修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌。本发明修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌为摩西球囊霉(G/o附^mo^^e,GM)HDSF1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.3012，保藏日期为2009年04月09日。本发明摩西球囊霉(G/om^mo^e"e，GM)HDSF1的孢子呈黄色或棕色、为球形、平均直径为210nm;摩西球囊霉(G7o附船wo^eae，GM)HDSF1连孢菌丝基部为漏斗形，菌丝直径为2030拜；成熟的摩西球囊霉(C7/o/m^moM^e，GM)HDSF1孢子壁由外向内分1^2和"两层，L2层呈淡黄色、厚度为1,21.6拜，L3层与L2层分离、为黄褐色、厚度平均为4.5拜。本发明未成熟的摩西球囊霉(G7owwsmo^eae，GM)HDSF1孢子壁由外向内分Lt、L2和L3三层，Li层位于孢子表面、透明，Mdzer，s试剂染色为粉红色，厚度平均为3.2^m。被阿特拉津污染的土壤中接种本发明修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌(摩西球囊霉HDSF1)后其上所播种的农作物植株的长势好，生物量比没有接种本发明修复丛枝菌根真菌的明显提高；而且土壤中的阿特拉津残留量大幅降低。本发明修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌摩西球囊霉(G/o附船mw化^，GM)HDSF1收集于哈尔滨杨马架子受农药阿特拉津残留污染较为严重的农田土壤。本发明修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌为摩西球囊霉HDSF1不受被修复土壤中土著微生物种群的影响，抗干扰性强；而且在土壤中阿特拉津浓度较低(10mg/kg浓度)情况下，依然能够保持良好的生物降解性，保持生物活性。摩西球囊霉(G/o/mw画鄉e，GM)HDSF1属于球囊霉属(G7o麵)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路中国科学院，保藏日期为2009年04月09日，保藏号为CGMCCNo.3012，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心建议的分类命名为摩西球囊霉G7o,<s附owae/。图1是具体实施方式二中丛枝菌根真菌摩西球囊霉成熟孢子400倍显微镜下观察图；图2是具体实施方式二中丛枝菌根真菌摩西球囊霉成熟孢子400倍显微镜下观察图；图3是具体实施方式二中丛枝菌根真菌摩西球囊霉成熟孢子400倍显微镜下观察图；图4是具体实施方式二中丛枝菌根真菌摩西球囊霉成熟孢子连续变倍体视镜下观察图；图5是具体实施方式二中丛枝菌根真菌摩西球囊霉成熟孢子连续变倍体视镜下观察图；图6是具体实施方式二中丛枝菌根真菌摩西球囊霉成熟孢子连续变倍体视镜下观察图。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌为摩西球囊霉(G/o/m^moM^e，GM)HDSF1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.3012，保藏日期为2009年04月09日。本实施方式修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌摩西球囊霉(G7wm^mow^^，GM)HDSF1收集于哈尔滨杨马架子受农药阿特拉津残留污染的农田土壤。摩西球囊霉(G7o附船wo^eae,GM)HDSF1按以下步骤收集、纯化一、挖取深度为030cm受农药阿特拉津残留污染的土壤，然后采用湿筛法从土壤中分离纯化丛枝菌根真菌孢子；二、将丛枝菌根真菌孢子浸泡在氯氨T质量浓度为2%和链霉素浓度为200mg/L的混合溶液中15min，然后用无菌水冲洗35次；三、采用单孢分离培养法获得纯系，并进行形态特征鉴定(确定为摩西球囊霉)；四、进行植株盆栽试验，将分离纯化得到的纯系丛枝菌根真菌接种到种植高粱的盆中，盆中混有一定浓度的阿特拉津污染土壤，然后在接种后第30天、第60天、第90天和第120天分别取样检测植株生物量、菌根真菌对宿主植物的侵染率、土壤中阿特拉津的残留量、土壤中各类酶活性变化情况和土壤根际微生物总体活性变化情况并从中选择出阿特拉津污染土壤修复效果最佳的丛枝菌根真菌，再进行分离、纯化，将得到的菌株命名为摩西球囊霉(G7oww;smoMeae,GM)HDSF1。将摩西球囊霉(G7om"s附ow'eae，GM)HDSF1扩培培养基质为草炭土、蛭石和沙子(三者体积比为2:3:5)的混合土壤，121°(:高温蒸汽灭菌1.511;宿主植物为高粱。将高粱种子催芽，播种在培养基质上，同时接种摩西球囊霉(G/o/m^mo^eae,GM)HDSF1，覆土约lcm，适量浇水，光照培养4个月，得到含有摩西球囊霉(G7o附w附oM^e,GM)HDSF1的孢子、菌丝片段及受真菌侵染的宿主根系，作为繁殖用菌种。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点是摩西球囊霉(G/o附w5mo^eae,GM)HDSF1的孢子呈黄色或棕色、为球形、平均直径为210pm;摩西球囊霉(G7o/m^wo^eae，GM)HDSF1连孢菌丝基部为漏斗形，菌丝直径为2030拜；成熟的摩西球囊霉(G/o附wjwoMMe，GM)HDSF1孢子壁由外向内分L2和L3两层，L2层呈淡黄色、厚度为L21.6拜，L3层与k层分离、为黄褐色、厚度平均为4.5pm。其它与实施方式一相同。成熟摩西球囊霉(G/omwsmo^eae，GM)HDSF1孢子的Lt层己经脱落。成熟摩西球囊霉HDSF1孢子如图16所示(成熟的6个不同摩西球囊霉HDSF1孢子)。摩西球囊霉(G7cww5/wo^eae，GM)HDSF1菌丝内有一个弯曲的厚隔膜，把孢子的内含物与菌丝的内含物隔离开。通过观察发现摩西球囊霉(G/om"smo^^,GM)HDSF1的胞壁比普通摩西球囊酶孢子胞壁厚。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是未成熟的摩西球囊霉(G/owwsmoM^e,GM)HDSF1孢子壁由外向内分L卜Ljt]L3三层，L,层位于孢子表面、透明，Mdzer，s试剂染色为粉红色，厚度平均为3.2pm。其它与实施方式一或二相同。具体实施方式四本实施方式进行丛枝菌根真菌摩西球囊霉(G/om"swo^e眠GM)HDSF1修复阿特拉津污染土壤对比实验步骤一、富集培养丛枝菌根真菌摩西球囊霉(C/o/mwmoMeae,GM)HDSFl至培养基质中摩西球囊霉HDSF1的孢子浓度为25个/g;步骤二、分为4大组进行盆栽实验(4组实验土壤均取自黑龙江大学试验田，测定其阿特拉津残留量为Omg/kg，土质情况相同，均不含有丛枝菌根真菌摩西球囊霉HDSFl，每盆装土3kg;表1中第1组处理每盆加入不含有HDSF1的60g用于培养HDSFl的基质，以保持组处理间植物生长的基质相同)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>天数实验数iff生物量株髙(cm>1845.348.950.336.85860.971.334.757.360.569.528.555.356.560阿特拉津残留量(mg/kg)37.825.410.14.592.652.071.390.484.133.211.951.395.544.542.832.64脲酶活性(mg/g干土)0.0220.0250.0290.0350.0310.0350.0510.0420.0390.0450.0520.0380.0340.0270.0360.041过氧化氢酶活性(mL/g干土)0.280.700.770.550.770.630.750.730.480.770.780.650.470.770.850.85『o頃G薪钐+3.6344.334.078.438.79.777.537.618.899.116.815.075.435.87放线菌(104个/g)11.230.5711.732.032.2321.731.891.991.761.533.131.531.33真菌(103个/g)0.630.731.51.431.81.733.52.81.821.563.392.730.870.982.772.63通过SPSS统计软件分析，第4组各项测定指标的实验数据均优于第1组，差异显著(p<0.05)，说明本发明修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌摩西球囊霉(C7/omwsmoMe^,GM)HDSFl能够帮助高粱降低阿特拉津毒害，使高粱的生物量、阿特拉津降解、脲酶活性、过氧化氢酶活性、根系土壤细菌、放线菌和真菌等指标均高于不接种丛枝菌根真菌处理。第2组和第3组数据说明丛枝菌根真菌可以在土壤中阿特拉津浓度较低的情况下，依然能够保持良好的生物降解性，保持生物活性。实验数据也说明本实施方式修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌摩西球囊霉HDSFl不受被修复土壤中土著微生物种群的影响，抗干扰性强。多组、多次重复实验证明丛枝菌根真菌摩西球囊霉HDSFl对土壤的修复效果与表1中计算出的数值基本相同。权利要求1、一株修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌，其特征在于其为摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)HDSF1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3012。2、根据权利要求1所述的一株修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌，其特征在于摩西球囊霉(G/o/m^moMMe,GM)HDSF1的孢子呈黄色或棕色、为球形、平均直径为210拜；摩西球囊霉(G7ow"s/m^e"e,GM)HDSF1连孢菌丝基部为漏斗形，菌丝直径为2030pm;成熟的摩西球囊霉(G7o/m^wo^eae,GM)HDSF1孢子壁由外向内分L2和Ls两层，L2层呈淡黄色、厚度为L21.6)im，L3层与L2层分离、为黄褐色、厚度平均为4.5拜。3、根据权利要求1或2所述的一株修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌，其特征在于未成熟的摩西球囊霉(G7omwwo^eae，GM)HDSF1孢子壁由外向内分L,、L2和L3三层，L,层位于孢子表面、透明，Mdzer，s试剂染色为粉红色，厚度平均为3.2拜。全文摘要一株修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌，它涉及一种微生物，特别是一株丛枝菌根真菌。本发明解决了目前采用生物修复阿特拉津污染土壤效果不理想的问题。本发明摩西球囊霉HDSF1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3012。被阿特拉津污染的土壤中接种本发明摩西球囊霉HDSF1后，其上所播种的农作物植株的长势好，生物量比没有接种本发明修复丛枝菌根真菌的明显提高；而且土壤中的阿特拉津残留量大幅降低。本发明修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌为摩西球囊霉HDSF1不受被修复土壤中土著微生物种群的影响，抗干扰性强；而且在土壤中阿特拉津浓度较低情况下，依然能够保持良好的生物降解性，保持生物活性。文档编号C12N1/14GK101597573SQ200910072348公开日2009年12月9日申请日期2009年6月23日优先权日2009年6月23日发明者丁明玲,孟剑侠,宋福强,范晓旭申请人:黑龙江大学