专利名称：一种鹅干扰素-α多肽基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鹅干扰素基因。
背景技术：
干扰素(interferon.IFN)最早是由英国科学家Isaacs和Lindemann于1957年 发现。1980年国际干扰素命名委员会正式将其定名为interferon,简写为IFN。 由于天然的鹅干扰素-a基因属于真核基因，所以在原核表达体系内存在低表达 和构建表达载体后转录的mRNA翻译活性低的问题。
大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，其遗传背景清楚、技术操作简单、培 养条件简单，可大规模发酵；因此倍受遗传工程专家的重视和青睐。目前大肠 杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常作为高效表达的首选体系；但是天 然的鹅干扰素-a基因却不能在大肠杆菌内表达，严重的限制了鹅干扰素-a在 实际禽类生产中的应用、推广和科学研究。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前天然的鹅干扰素-a基因在大肠杆菌内不能 表达的问题，而提供的一种鹅干扰素-a多肽基因。
本发明鹅干扰素-a多肽基因序列如SEQIDNO: 1所示。
本发明鹅干扰素-a多肽基因全长505bp， 10bp处有起始密码子ATG， 496bp 处有终止密码子TAA，拥有489bp完整的开放阅读框。
本发明鹅干扰素-a多肽基因所编码的氨基酸序列与天然的鹅干扰素-ot多 肽相同(鹅干扰素-a多肽18.83ku)，但本发明鹅干扰素-a多肽基因序列中4bp 6bp处的碱基为"TGT"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"TGC")， 16bp 27bp处的碱基为"CGTCTGCATGAT"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为 "CGCCTCCACGAC")， 31bp 33bp处的碱基为"GCA"(此处天然鹅干扰素 -a多肽基因碱基为"GCC")， 37bp 39bp处的碱基为"CCG"(此处天然鹅干 扰素-a多肽基因碱基为"CCC")， 49bp 51bp处的碱基为"CTG"(此处天然 鹅干扰素-cx多肽基因碱基为"CTC")， 55bp 66bp处的碱基为"CTGCTGTGTAAT "(此处天然鹅干扰素-(x多肽基因碱基为
"CTCCTCTGCAAC")， 70bp 75bp处的碱基为"GCACCG"(此处天然鹅干 扰素-a多肽基因碱基为"GCTCCC")， 82bp 84bp处的碱遙为"ACC"(此处 天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"ACA")， 88bp 卯bp处的碱基为"CCG"
(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CCC")， 103bp 105bp处的碱基为
"CAC"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CAT"), 109bp mbp处的 碱基为"CCG"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CCT")， 115bp 117bp 处的碱基为"AGC"(此处天然鹅干扰素-(x多肽基因碱基为"TCC")， 127bp 132bp处的碱基为"ACGCTG"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为
"ACCCTC")， 136bp 138bp处的碱基为"GAT"(此处天然鹅干扰素-a多肽 基因碱基为"GAC")， 148bp 150bp处的碱基为"ACC"(此处天然鹅干扰素 -a多肽基因碱基为"ACA")， 160bp 162bp处的碱基为"AGC"(此处天然鹅 干扰素-a多肽基因碱基为"TCA")， 166bp 174bp处的碱基为"GCGACGCTG"
(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"GCCACCCTC")， 178bp 186bp处 的碱基为"CTGCTGCAG"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为
"CTCCTCCAA")， 190bp 192bp处的碱基为"CTG"(此处天然鹅干扰素"(x 多肽基因碱基为"CTC")， 196bp 198bp处的碱基为"GAT"(此处天然鹅干 扰素-a多肽基因碱基为"GAC")， 202bp 204bp处的碱基为"CTG"(此处天 然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CTC")， 211bp 213bp处的碱基为"CCG"(此 处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CCC")， 217bp 222bp处的碱基为
"ACGCCG"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"ACCCCC")， 232bp 234bp处的碱基为"CTG"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CTC")， 253bp 255bp处的碱基为"CTG"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为
"CTC")， 256bp 258bp处的碱基为"CTG"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因 碱基为"CTC")， 265bp 267bp处的碱基为"CTG"(此处天然鹅干扰素-a多 肽基因碱基为"CTC"), 271bp 276bp处的碱基为"CATCAT"(此处天然鹅 干扰素-a多肽基因碱基为"CACCAC")， 283bp 294bp处的碱基为
"CATCTGGAACGT "(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为
"CACCTCGAGCGC")， 301bp 306bp处的碱基为"CCGGCA"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CCAGCC"), 313bp 315bp处的碱基为"ACC" (此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"ACG"), 322bp 333bp处的碱基为 "CATCGTCGCGGC "(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为 "CACAGGCGAGGG")， 337bp 339bp处的碱基为"CGT"(此处天然鹅干 扰素-a多肽基因碱基为"CGC")， 343bp 345bp处的碱基为"CTG"(此处天 然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CTT")， 349bp 354bp处的碱基为"CTGGGT" (此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CTCGGC")， 361bp 366bp处的碱 基为"AAATAT"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"AAGTAC")， 370bp 372bp处的碱基为"GGT"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"GGC")， 379bp 381bp处的碱基为"CAG"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为 "CAA")， 388bp 390bp处的碱基为"CTQ"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因 碱基为"CTC")， 397bp 399bp处的碱基为"CAT"(此处天然鹅干扰素-a多 肽基因碱基为"CAC")， 409bp 414bp处的碱基为"CCGTGT"(此处天然鹅 干扰素-a多肽基因碱基为"CCCTGC"), 427bp 447bp处的碱基为 "GTTCGTCTGGAAGCGCATGCA"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为 "GTCCGCCTCGAGGCTCACGCC")， 451bp 453bp处的碱基为"TTT"(此 处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"TTC")， 457bp 459bp处的碱基为"CGT" (此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CGC")， 460bp 465bp处的碱基为 "ATTCAT"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"ATCCAC")， 469bp 471bp处的碱基为"CTG"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为"CTC"), 475bp 480bp处的碱基为"CGTACG"(此处天然鹅干扰素-a多肽基因碱基为 "CGCACC")， 484bp 486bp处的碱基为"CGT"(此处天然鹅干扰素-a多肽 基因碱基为"CGC")。
本发明利用大肠杆菌优势表达基因(偏爱密码子)对鹅干扰素-a多肽基因 进行基因改造；由于密码子的改变本发明的鹅干扰素-a多肽基因的密码子及密 码子对均为优势密码子和密码子对，所以本发明的鹅干扰素-a多肽基因在大肠 杆菌中的蛋白表达量明显提高，密码子分析结果如图2所示，明显强于天然鹅 干扰素-a多肽基因(如图l所示)，因此本发明鹅干扰素-a多肽基因可以在大 肠杆菌中高效表达鹅干扰素-a成熟多肽。本发明的鹅干扰素-a多肽基因的5'端自由能图如图3所示，天然鹅干扰 素-a多肽基因的5'端自由能图如图4所示，本发明鹅干扰素-a多肽基因的3' 端自由能图如图5所示，天然鹅干扰素-a多肽基因的3'端自由能图如图6所 示；经RNAstructure(Version4.3)软件分析本发明鹅干扰素-a多肽基因的5，端 自由能高于天然鹅干扰素-a多肽基因，而且在本发明鹅干扰素-a多肽基因翻 译起始区周围的序列不形成明显的二级结构，使翻译起始调控元件易被核糖体 识别和结合，所以本发明的鹅千扰素-a多肽基因转录后mRNA的二级结构明 显优于天然鹅干扰素-a多肽基因，提高了鹅干扰素-a在大肠杆菌系统中的表 达量，实现了高效表达。
图1是天然鹅干扰素-a多肽基因在大肠杆菌中密码子分析结果图；图2 是本发明鹅干扰素-a多肽基因在大肠杆菌中密码子分析结果图；图3是本发明 鹅干扰素-a多肽基因的5'端自由能图，图4是天然鹅干扰素xx多肽基因的5， 端自由能图；图5是本发明鹅千扰素-a多肽基因的3，端自由能图；图6是天 然鹅干扰素-a多肽基因的3'端自由能图；图7是鹅干扰素-a多肽基因在大肠 杆菌BL21中非融合表达的SDS-PAGE检测结果图，图7中"1"泳道标样为 Marker (蛋白标准分子量)，"2"泳道标样为载有天然鹅干扰素-a多肽基因的 pWL载体在大肠杆菌中的诱导表达产物，"3"泳道标样为空载体，"4"泳 道标样为载有具体实施方式
一鹅干扰素-(x多肽基因的pWL载体在大肠杆菌中 lh的诱导表达产物，"5"泳道标样为载有具体实施方式
一鹅干扰素-a多肽基 因的pWL载体在大肠杆菌中2h的诱导表达产物，"6"泳道标样为载有具体 实施方式一鹅干扰素-a多肽基因的pWL载体在大肠杆菌中3h的诱导表达产 物。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一:本实施方式本实施方式鵝干扰素-ct多肽基因序列如下所
示
GAATTCAATATGTGTAGCCCGCTGCGTCTGCATGATAGCGCATTTCCGTGGGACAGCCTGCAGCTGCTGTGTAATATGGCACCGAGCCCGACCCAGC
CGTGCCCGCAGCAACACGCACCGTGCAGCTTCCCGGACACGCTGCTGGA
TACCAACGACACCCAGCAAGCCAGCCACGCGACGCTGCACCTGCTGCA
GCACCTGTTCGATACCCTGAGCAGCCCGAGCACGCCGGCGCACTGGCTG
CACACCGCACGCCACGACCTGCTGAACCAGCTGCAGCATCATATCCACC
ATCTGGAACGTTGCTTCCCGGCAGACGCGACCCGCTTCCATCGTCGCGG
CCCGCGTAACCTGCACCTGGGTATCAACAAATATTTCGGTTGCATCCAGC
ACTTCCTGCAGAACCATACCTACAGCCCGTGTGCCTGGGACCACGTTCG
TCTGGAAGCGCATGCATGCTTTCAGCGTATTCATCGCCTGACCCGTACGA
TGCGTTAATGTCGAC 。
本实施方式鹅干扰素-a多肽基因序列由上海生物工程技术服务有限公司 合成。
本实施方式中借助DNAstar软件推导基因的氨基酸序列，并根据氨基酸序 列借助http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html在线密码子分析工具推导大肠 杆菌优势表达的基因序列。
本实施方式用RNAstructure(Version4.3)软件设计基因5'末端及3'末端 自由能值，提高鹅干扰素-cx多肽基因的mRNA的5'端自由能值，使得核糖 体结合位点区域二级结构简单；并降低3'端结构稳定性提高，延长mRNA 在体内的半衰期。
将本实施方式鹅干扰素-a多肽基因转入原核无毒编码物种特异性抗性表 达载体(pWL载体)，然后在大肠杆菌BL21中进行非融合表达，通过SDS-PAGE 鉴定产物表达量。
SDS-PAGE电泳采用15% (体积)的分离胶和5% (体积)的浓缩胶进行； 所需溶液按以下步骤配制(1) 5xTris-甘氨酸电泳缓冲液15.1gTris, 94g甘 氨酸，2.5gSDS溶于900mL去离子水中，定容至1L;
(2) 10% (g/mL)过硫酸铵O.lg过硫酸铵溶于lmL重蒸水中，在-20 。C冰箱中保存；
(3) 10% (g/mL) SDS:称10g SDS用重蒸水溶解，定容到100mL，室 温存放；(4) 30% (g/mL)丙烯酰胺将29g丙烯酰胺和lgN-N-甲叉丙烯酞胺加 去离子水定容至100mL， pH《7.0，过滤，于棕色玻璃瓶中4(TC贮存；
(5) 1.5MTris-HCl (pH8.8): Tris-碱18.17g溶于80mL去离子水中，加入 约3mL的浓盐酸调pH至8.8，定容至100mL;
(6) 1.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8):称Tris 109g，取lmol/LHCl 144mL, 用重蒸水定容至300mL， 4'C保存。
检测结果如图7所示，检测结果显示本实施方式鹅干扰素-a多肽基因在大 肠杆菌中进行了高效表达，蛋白表达量占菌体总蛋白的35%以上(而天然的鹅 干扰素-a多肽基因连接到pWL载体中在大肠杆菌中则检测不出表达)，说明 本实施方式鹅干扰素-cx多肽基因可以在大肠杆菌表达系统内高效表达。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是鹅干扰素-a 多肽基因序列10bp处有起始密码子ATG， 496bp处有终止密码子TAA,拥有 489bp完整的开放阅读框。其它与实施方式一相同。序列表
<110>东北农业大学
<120> —种鹅干扰素-a多肽基因
<勝2
〈210〉 1 〈211〉 505 〈212〉 ■ 〈213〉人工序列
<220> <221> CDS
<222> (IO)... ( 489) <220〉
〈223>鹅干扰素-a多肽基因 〈400> 1
gaattcaat atg tgt age ccg ctg cgt ctg cat gat age gca ttt ccg 48 Met Cys Ser Pro Leu Arg Leu His Asp Ser Ala Phe Pro 1 5 10
tgg gac age ctg cag ctg ctg tgt aat atg gca ccg age ccg acc cag 96 Trp Asp Ser Leu Gin Leu Leu Cys Asn Met Ala Pro Ser Pro Thr Gin
15 20 25
ccg tgc ccg cag caa cac gca ccg tgc age ttc ccg gac acg ctg ctg 144 Pro Cys Pro Gin Gin His Ala Pro Cys Ser Phe Pro Ser Thr Leu Uu 30 35 40 45
gat acc aac gac acc cag caa gcc age cac gcg acg ctg cac ctg ctg 192 Asp Thr Asn Asp Thr Gin Gin Ala Ser His Arg Thr Leu His Leu Leu ,
50 55 60
cag cac ctg ttc gat acc ctg age age ccg age acg ccg gcg cac tgg 240 Gin His Gin Phe Asp Thr Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp
65 70 75
ctg cac acc gca cgc cac gac ctg ctg aac cag ctg cag cat cat ate 288 Leu His Thr Ala Arg His Asp Leu Leu Asn Gin Leu Gin His His lie
80 85 90
cac cat ctg gaa cgt tgc ttc ccg gca gac gcg acc cgc ttc cat cgt 336 His His Leu Glu Arg Cys Phe Pro Ala Asp Ala Thr Arg Phe His Arg
95 100 105
cgc ggc ccg cgt aac ctg cac ctg ggt ate aac aaa tat ttc ggt tgc 384 Arg Gly Pro Arg Asn Leu His Leu Gly Met Asn Lys Tyr Phe Gly Cys 110 115 120 125
ate cag cac ttc ctg cag aac cat acc tac age ccg tgt gcc tgg gac 432lie GinHisPheLeuGin AsnHisThrTyr Ser Pro Cys Thr Trp Ser
130135140
cac gttcgtctggcgcatgcatgctttcag cgtattcatcgcctg
His ValArgLeuGluAla HisAlaCysPheGin Arg lie His Arg Leu
145150155
acc cgtacgatgCgttgtcgac505
Thr ArgThrMetArg
160
<210> 2
<211〉 162
〈212〉 PRT
〈213〉天鹅属(O^/ws)
〈400> 2
Met CysSerProLeuArgLeuHisAspSerAlaPheProTrpAspSer
151015
Leu GinLeuLeuCysAsnMetProSerProThrGinProCysPro
202530
Gin GinHisAlaProCysSerPheProSerThrLeuLeuAspThrAsn
354045
Asp ThrGinGinAlaSerHisArgThrLeuHisLeuLeuGinHisGin
505560
Phe AspThrLeuSerSerProSerThrProAlaHisTrpLeuHisThr
65707580
Ala ArgHisAspLeuLeuAsnGinLeuGinHisHislieHisHisLeu
859095
Glu ArgCysPheProAlaAspAlaThrArgPheHisArgArgGlyPro
100105110
Arg AsnLeuHisLeuGlyMetAsnLysTyrPheGlyCyslieGinHis
115120125
Phe LeuGinAsnHisThrTyrSerProCysThrTrpSerHisValArg
130135140
Leu GluAlaHisAlaCysPheGinlieHisArgLeuThrArgThr
145150155160
Met Arg
权利要求
1、一种鹅干扰素-α多肽基因，其特征在于鹅干扰素-α多肽基因序列如下所示GAATTCAATATGTGTAGCCCGCTGCGTCTGCATGATAGCGCATTTCCGTGGGACAGCCTGCAGCTGCTGTGTAATATGGCACCGAGCCCGACCCAGCCGTGCCCGCAGCAACACGCACCGTGCAGCTTCCCGGACACGCTGCTGGATACCAACGACACCCAGCAAGCCAGCCACGCGACGCTGCACCTGCTGCAGCACCTGTTCGATACCCTGAGCAGCCCGAGCACGCCGGCGCACTGGCTGCACACCGCACGCCACGACCTGCTGAACCAGCTGCAGCATCATATCCACCATCTGGAACGTTGCTTCCCGGCAGACGCGACCCGCTTCCATCGTCGCGGCCCGCGTAACCTGCACCTGGGTATCAACAAATATTTCGGTTGCATCCAGCACTTCCTGCAGAACCATACCTACAGCCCGTGTGCCTGGGACCACGTTCGTCTGGAAGCGCATGCATGCTTTCAGCGTATTCATCGCCTGACCCGTACGATGCGTTAATGTCGAC。
2、 根据权利要求l所述的一种鹅干扰素-a多肽基因，其特征在于鹅干扰 素-a多肽基因序列lObp处有起始密码子ATG, 496bp处有终止密码子TAA， 拥有489bp完整的开放阅读框。
全文摘要
一种鹅干扰素-α多肽基因，它涉及一种鹅干扰素-α基因。它解决了目前天然的鹅干扰素-α基因在大肠杆菌内不能表达的问题。本发明鹅干扰素-α多肽基因序列如SEQ ID NO1所示。本发明木糖还原酶基因序全长505bp，10bp处有起始密码子ATG，496bp处有终止密码子TAA，有489bp完整的开放阅读框。本发明鹅干扰素-α多肽基因能够在大肠杆菌表达系统中高效表达鹅干扰素-α成熟多肽。本发明的鹅干扰素-α多肽基因转录后mRNA的二级结构明显优于天然鹅干扰素-α多肽基因，提高了鹅干扰素-α在大肠杆菌系统中的表达量，实现了高效表达。
文档编号C12N15/19GK101603043SQ20091007233
公开日2009年12月16日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者巍 王, 王君伟, 波 马, 高明春 申请人:东北农业大学