专利名称：一种瘤菌根真菌及其在促进环草石斛生长中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种瘤菌根真菌及其在促进环草石斛生长中的应用。
背景技术：
兰科植物与其菌根真菌存在着密切关系，在自然状态下兰科植物种子萌发成原球茎(根状茎)到第一片真叶长出阶段都需要菌根真菌，甚至有些有叶幼苗的生长发育完全依赖或部分依赖菌根真菌，菌根真菌可为兰科植物提供N源、C源和矿物质。研究表明同种真菌可与多种兰科植物共生，研究报道兰科菌根真菌分泌B族维生素和赤霉素，对植物生长有影响。环草石斛(Dendrobium loddigesii Rolfe)为兰科石斛属多年生草本植物，为贵州地道药材，是我国传统名贵中药。环草石斛生长缓慢，自然繁殖系数低，但需求量却日益增多，虽然环草石斛组培已经成功，但组培苗移栽成活率低且生长缓慢，这阻碍着环草石斛的产业化发展。目前未见用外源兰科植物菌根真菌对环草石斛生长方面的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有环草石斛生长缓慢，繁殖系数低、成活率低的缺陷，提供一种瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株及其在促进环草石斛生长中的应用。为了解决上述技术问题，本发明利用兰科植物与其内生真菌专一性低的特点，用春兰(JJymbidium georingii Rchb. f.)菌根真菌与环草石斛接种共生，筛选出促进环草石斛组培苗生长的菌株，以期提高环草石斛组培苗移栽成活率和提高产量，为生产促进环草石斛生长的微生物肥料打下基础。本发明瘤菌根真菌Epulorhiza repens CGO!35菌株。将贵州春兰( georingii Rchb. f.)的根洗净，参照单菌丝团分离法(专利号ZL200610051196. 2)，接种在PDA培养基上，纯化，保存于4°C备用，培养后与环草石斛共生，经系列生长指标评价试验筛选获得。该CG035菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学生科院保藏中心；邮编430072)，其保藏编号是CCTCC NO. M 2010370， 保藏日期为2010年12月观日，分类命名为瘤菌根真菌，拉丁文学名为劭WorAi拟 repens。上述瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株的生物学形态特征描述为在标准BDPDA培养基上生长，早期菌丝贴培养基生长，菌丝乳白色，蜡质，菌落边缘整齐，厚度均勻，菌落边缘侵入培养基生长，后期产生稀疏白色蛛网状气生菌丝，菌丝生长速度0. 088mm/ h,菌丝直径2. 27 5. 37 μ m,细胞长13. 05 98. 65 μ m,念珠状细胞球形，常形成长链，大小6. 17 18. 25X7. 47 16. 35 μ m，菌丝有隔，细胞核为双核，菌丝隔为桶孔隔膜，桶孔覆垫无穿孔，弧形。
前述瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1。前述瘤菌根真菌Epulorhiza repens CGO!35 菌株 CCTCC NO. M2010370 在促进环草石斛生长中的应用。本发明还提供了一种瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO. M2010370与环草石斛共生培养的方法将在PDA培养基上活化的瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株用孔径为5. Omm的打孔器打取菌片，接种在共生培养基上， 培养15天，在无菌条件下将3 4叶组培苗接入共生培养基中，自然条件下的温度和光照培养。上述方法中所述的共生培养基是由蛭石、锯木屑和苔鲜组成，其体积比为1:1:1。前述共生培养基在121°C灭菌1小时，1天后同样方法再灭菌一次。上述技术方案中的瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO. M2010370的微生物学特征如下
1、形态特征在标准BDPDA培养基上生长，早期菌丝贴培养基生长，菌丝乳白色，蜡质， 菌落边缘整齐，厚度均勻，菌落边缘侵入培养基生长，后期产生稀疏白色蛛网状气生菌丝， 菌丝生长速度0. 088mm/h,菌丝直径2. 27 5. 37 μ m,细胞长13. 05 98. 65 μ m,念珠状细胞球形，常形成长链，大小6. 17 18. 25 X 7. 47 16. 35 μ m，菌丝有隔，细胞核为双核，菌丝隔为桶孔隔膜，桶孔覆垫无穿孔，弧形。2、生理生化特征纤维素酶活阳性，多酚氧化酶活阴性。3、菌丝体所含物质菌丝体含有B族维生素和赤霉素。具有上述特征的菌株，参照(Currah R. S. et al.，1997)等资料，综合生理生化特征，ITS序列结果，鉴定为瘤菌根真菌(^OThrAiza repens),命名为CG035。与现有技术相比，本发明是一种新的瘤菌根真菌，鉴定为CG035菌株，保藏编号为 CCTCC N0.M2010370，发明人对其促进环草石斛生长的作用进行了验证
1、瘤菌根真菌^oWorAiza repens CG035菌株的分离
将贵州春兰的根洗净，参照单菌丝团分离法(专利号ZL200610051196. 2)，接种在PDA 培养基上，纯化，得瘤菌根真菌处WorAiza repens CG035菌株，保存于4°C备用。2、将在PDA培养基上活化的CG035菌株用孔径为5. Omm的打孔器打取菌片， 接种在共生培养基质(蛭石锯木屑苔鲜的体积比为1 :1 :1，在121°C灭菌1小时，1天后同样方法再灭菌一次)上，培养15天，在无菌条件下将3 4叶的组培苗接入共生培养基中，每瓶接种3颗苗，簇拥，重复5瓶，每瓶苗根数、茎长、茎粗细大致一致。自然条件下的温度和光照，培养80天。3、环草石斛组培苗的生长和重量测定
接种前，在无菌情况下洗去祖培苗上的琼脂，再用滤纸吸干表面水分，用电子天平准确称量环草石斛组培苗的重量，并记录根的数量和长度，茎高和茎宽。培养80天后，将苗从组培瓶(罐头瓶)中取出，小心洗去培养基及附着于根上的菌丝，用滤纸吸干表面水分，称重， 与接种真菌前的苗重、苗高、根数、根长、茎粗相减即得苗重、苗高、根数、根长、茎粗增加；利用SPSS软件进行单因素方差分析。结果如表1所示。表1共培养80天瘤菌根真菌处WorAiza repens CG035菌株对环草石斛生长效应
权利要求
1.瘤菌根真菌^OThrAizarepens CG035菌株，其保藏编号为CCTCC NO. M2010370。
2.按照权利要求1所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC N0.M2010370，其特征在于生物学形态特征描述为在标准BDPDA培养基上生长，早期菌丝贴培养基生长，菌丝乳白色，蜡质，菌落边缘整齐，厚度均勻，菌落边缘侵入培养基生长， 后期产生稀疏白色蛛网状气生菌丝，菌丝生长速度0. 088mm/h，菌丝直径2. 27 5. 37 μ m, 细胞长13. 05 98. 65 μ m,念珠状细胞球形，常形成长链，大小6. 17 18. 25X7. 47 16. 35 μ m,菌丝有隔，细胞核为双核，菌丝隔为桶孔隔膜，桶孔覆垫无穿孔，弧形。
3.按照权利要求1所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC NO. M2010370，其核苷酸序列如 SEQ ID NO :1。
4.瘤菌根真菌Epulorhizarepens CGO；35菌株CCTCC NO. M2010370在促进环草石斛生长中的应用。
5.瘤菌根真菌Epulorhizarepens CGOIB5菌株CCTCC NO. M2010370与环草石斛共生培养的方法，其特征在于将在PDA培养基上活化的瘤菌根真菌处WorAiza repens CG035 菌株用孔径为5. Omm的打孔器打取菌片，接种在共生培养基上，培养15天，在无菌条件下将 3 4叶组培苗接入共生培养基中，自然条件下的温度和光照培养。
6.按照权利要求5所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC NO. M2010370与环草石斛共生培养的方法，其特征在于所述共生培养基是由蛭石、锯木屑和苔鲜组成，其体积比为1:1:1。
7.按照权利要求6所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC NO. M2010370与环草石斛共生培养的方法，其特征在于所述的共生培养基在121°C灭菌1 小时，1天后同样方法再灭菌一次。
全文摘要
本发明公开了一种瘤菌根真菌EpulorhizarepensCG035菌株及其在促进环草石斛生长中的应用，CG035菌株的保藏编号为CCTCC NO.M2010370，可用于与环草石斛共生培养以促进环草石斛的生长。
文档编号C12N1/14GK102154122SQ20111002307
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者刘作易, 朱国胜, 桂阳 申请人:贵州省果树科学研究所